EGCG对中波紫外线辐射后原代人角质形成细胞中光产物产生和清除影响.docVIP

EGCG对中波紫外线辐射后原代人角质形成细胞中光产物产生和清除影响 　　[摘要]目的：观察中波紫外线（UVB）辐射后人原代角质形成细胞中环丁烷嘧啶二聚体（cyclobutane pyrimidine dimmers，CPDs）的生成和清除情况，以及没食子儿茶素没食子酸酯 （epigallocatechingallate，EGCG）干预对上述过程的影响。方法：以不同剂量UVB照射原代角质形成细胞后并加入EGCG干预处理，采用免疫组织化学法检测UVB照射后不同时段细胞中CPDs的产生和清除情况。结果： UVB照射后细胞中CPDs开始产生，1h左右达到高峰；CPDs在照光后4h内清除速率较快，4h后清除速率逐渐降低，至24hCPDs被基本清除。照光前后加入EGCG干预减少UVB引起的35.7%～42.9%CPDs产生（P0.05）。结论：UVB可明显引起原代人角质形成细胞损伤，受损程度随辐射剂量增大而加重；EGCG可以减少UVB辐射所致的光产物的产生，加速光产物的清除。 　　[关键词]UVB辐射；人原代角质形成细胞；环丁烷嘧啶二聚体；EGCG 　　[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）11-1967-04 　　日光中和皮肤癌相关的紫外线可以分为UVA（320～400nm）、UVB（280～320nm）、UVC（200～280nm）。UVB可导致DNA的标志性损伤即光产物形成[1-2]，包括6-4光产物（（6-4）PPs）和嘧啶或环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）。CPDs约占75%左右，是主要的光产物。这些DNA损伤如没有修复或修复不完善，可以产生基因突变，成为皮肤癌的初始改变。生物体天然固有切除和修复光产物的能力，这种切除修复能力会受到多种外界因素如药物的影响。现有研究表明绿茶提取物茶多酚（Teapol， TP）中的主要活性成分EGCG具有抗衰老、抗氧化、抗肿瘤和免疫调节等多种作用，既往我们已报道EGCG有较强的抗紫外线能力，但其对UVB辐射后人皮肤原代KC中光产物产生及清除的影响还未见报道[3-6]。本研究主要观察UVB辐射后人皮肤原代KC中CPDs产生和清除的情况，以及EGCG对上述过程的影响。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料与仪器：EGCG（美国Sigma生物公司）；K-SFM培养基（美国 GIBCO生物公司）；加人中性蛋白酶（Dispase）（美国Sigma生物公司）；CPDs单克隆抗体（美国Sigma生物公司）；免疫组化试剂盒和 DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。SUV-100日光紫外线模拟器及UVB辐照度监示器（上海西格玛高技术有限公司），EGCG溶液配制浓度为1mg/ml。 　　1.2 人原代KC的分离与培养：参照文献方法[4]，将正常成人环切术后的包皮用碘伏浸泡，漂洗3次；剪成0.5cm×0.5cm大小皮片；0.5%中性蛋白酶 4℃下消化16～18h，分离真、表皮；表皮部分用表皮消化液（0.1% 胰蛋白酶：0.01% EDTA=1：1）在37℃下消化10～12min后200目尼龙网过滤，离心，加入K-SFM培养基于37 C、5% CO2下培养。培养的细胞以调整浓度为1×106/ml，定量接种于直径3.5cm培养皿中继续培养。待细胞长至70%～80%融合时用于实验。 　　1.3 细胞爬片：将24mm×24mm的盖玻片泡酸、冲洗、烘干、消毒备用。将原代KC调整其浓度为1×106/ml，将无菌盖玻片放入6孔板中，每张滴加0.6ml细胞悬液继续培养。细胞80%融合后进行EGCG干预处理及UVB照射。 　　1.4 UVB照射及EGCG干预处理：将原代KC分为对照组、时间组、剂量组和EGCG处理组。时间组以30mJ/cm2UVB照射，照光后1h、4h、8h、12h及24h进行实验；剂量组接受不同剂量（30、60和90mJ/cm2）UVB辐射，辐射后4h进行免疫组化实验；EGCG组以30mJ/cm2UVB辐射，照光前4h及照光后加入200μg/ml EGCG与细胞共孵育，4h后进行检测。每组设3个平行培养孔。UVB辐照剂量=UVB辐照度×时间（s）。 　　1.5 免疫组织化学法检测CPDs：按说明书进行操作。盖玻片以丙酮液固定，滴加1：1000稀释的鼠抗人CPDs单抗，以DAB显色及苏木素复染，经脱水、透明及封片后显微镜下观察拍照。阳性细胞为胞核棕黄色着色，连续观察5～10个高倍视野（×400），计数200个细胞总数的阳性细胞数， 采用u检验进行统计分析。 　　2 结果 　　2.1 UVB辐射导致人原代KC中CPDs生成：如图1A到图1C所示，UVB辐射可以损伤细胞，引起光产物产生，我们采用免疫组织化学法检测CPDs的产生情况，有CPDs生成的细胞在图中表现为具