p21基因启动子甲基化对血管平滑肌细胞向泡沫细胞转化影响.docVIP

p21基因启动子甲基化对血管平滑肌细胞向泡沫细胞转化影响 　　摘要：目的 观察氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）对血管平滑肌细胞（VSMC）p21基因启动子甲基化及对VSMC向泡沫细胞转化的影响。方法 采用组织贴块法培养人脐血管平滑肌细胞，给予不同浓度氧化低密度脂蛋白ox-LDL（0，10mg/L，20mg/L，40mg/L）孵育24h，甲基化特异PCR（MS-PCR）检测p21基因启动子区CpG岛甲基化程度，MTT比色法测定VSMC增殖活性，油红O染色镜下观察计数泡沫细胞比率。结果 ox-LDL呈浓度依赖性促进p21启动子甲基化，同时平滑细胞增殖活性增高，向泡沫细胞转化增加。结论 ox-LDL 可以通过p21基因甲基化促进VSMC向泡沫细胞转化，p21基因甲基化可能在动脉粥样硬化发生中起到一定作用。 　　关键词：p21基因；甲基化；动脉粥样硬化 　　动脉中膜血管平滑肌细胞（VSMC）发生增殖和迁移并转化为泡沫细胞是动脉粥样硬化（AS）形成过程中的核心事件。细胞周期是各种因素刺激细胞增殖的最后信号通路，p21是体内最重要的细胞周期蛋白，可与几乎每一个Cyclin-CDK复合物结合并使其失活，从而阻碍细胞进入增殖期。p21等在高胆固醇等促AS因子作用下表达下调，导致动脉平滑肌细胞增殖和迁移， 但在此过程中没有发现p21基因的突变，从而使传统遗传学理论对此无法解释。表观遗传学理论，尤其是DNA甲基化为解决AS等多基因遗传疾病提供了新的思路。DNA甲基化不改变基因编码序列，但启动子区高甲基化将导致基因表达抑制和基因沉默。本课题观察p21基因甲基化对泡沫细胞形成的影响，为阐明AS发病机制提供理论依据。 　　1资料与方法 　　1.1一般资料 Gp Genome DNA修饰试剂盒购自Chmicon，PCR试剂盒购自赛百盛公司，四甲基偶氮唑盐和二甲基压砜购自Sigma公司，细胞培养基、小牛血清等购自Gibico。常规化学试剂为国产分析纯试剂。 　　1.2方法 　　1.2.1人血管平滑肌细胞的培养：无菌取剖宫产胎儿脐动脉，剥取中膜按贴块法培养VSMC，取第3-5代用于实验研究。实验前以无血清培养基培养12h使细胞处于静止状态。在无血清培养液中加入0.2%牛血清白蛋白，然后加入不同浓度OX-LDL刺激24h，未加刺激同时孵育24h细胞作为对照。 　　1.2.2氧化低密度脂蛋白的制备（ox-LDL）：采用非连续性密度梯度超速离心法分离提取LDL。新鲜人不抗凝血低速离心分离血清，用溴化钾调节密度至1.3g/ml，4°C 50000r/min离心5h，收集LDL，PBS透析，超滤除菌后4°C保存。Lowry法定氮，采用硫酸铜诱导氧化修饰，置于PBS中透析24h后4°C保存备用。 　　1.2.3 p21 基因甲基化检测：采用甲基化特异性PCR法。饱和酚-氯仿法提取样本DNA，取溶解的DNA样本1ug，参照Gp Genome DNA修饰试剂盒（Chmicon公司）应用亚硫酸盐修饰，回收后提纯行PCR反应。p21甲基化特异引物上游序列为5′-TACGCGAGGTTTCGGGATCG-3′，下游序列 5′-AAAAACGACCCGCGCTCG-3′，扩增产物片段为133bp；p21非甲基化特异引物上游序列为5′-TATGTGAGGTTTTGGGATTGG-3′，下游序列 5′-AAAAACAACCCACACTCAACC-3′，扩增产物片段为133bp。引物由赛百盛生物公司合成。建立50μl反应体系，内含10×反应缓冲5μl ，dNTP1μl，上下游引物各20pmol，Taq酶0.5单位，模板 DNA 5μL，双蒸水补至50μl，覆盖石蜡油，940C 5min 后，进入940C变性1 min ，670C复性1 min ，720C延伸1 min的循环，共35个循环，最后720C延伸5 min，产物行琼脂糖凝胶电泳分离，拍照后扫描条带，以同一样本甲基化条带与非甲基化条带之比进行甲基化程度半定量。 　　1.2.4 细胞增殖活力检测 MTT比色法。细胞弃去培养液，PBS洗涤，再加入20μL MTT工作液及200μL培养液，4h后吸去上清，每孔加入二甲基亚砜150μL，充分振荡使结晶物融解，490mm波长在酶标仪上测定各孔光吸收值，以试验孔OD均值/对照孔OD均值作为细胞增殖的相对活性。 　　1.2.5 泡沫细胞的半定量 细胞油红O染色，拍照后利用图像扫描仪根据细胞脂滴的面积进行细胞分类。细胞脂滴的面积小于细胞核的面积者记为-，面积等于或大于细胞核的面积记为+，即为泡沫细胞，每一块玻片计数100个细胞，计算泡沫细胞的阳性率 　　1.3统计学分析 计量资料数据采用x±s表示，计数资料以百分比（%）表示，所有统计分析均在SPSS12.0软件上进行。P