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PCR方法检测大肠杆菌iss基因缺陷及改进 　　摘要：采用KOD酶和rTaq酶，分别通过套式PCR检测10株大肠杆菌iss基因，以探讨PCR检测大肠杆菌iss基因的缺陷及改进方法。结果表明，rTaq酶、KOD酶对大肠杆菌iss基因1次PCR检出率分别为40%、70%，套式PCR检出率分别为80%、100%；KOD酶1次PCR检出率高于rTaq酶，但未达100%，采用KOD酶套式PCR可降低大肠杆菌iss基因的漏检可能性。 　　关键词：PCR检测；iss基因；套式；检出率；大肠杆菌 　　中图分类号： S852.61+2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0069-02 　　收稿日期：2014-11-07 　　基金项目：国家自然科学青年基金（编号。 　　作者简介：樊琛（1978―），女，山东聊城人，博士，副教授，主要从事病原体分子生物学、食品安全研究。E-mail：fanchen7810@126.com。iss基因（increased serum survival gene）是编码大肠杆菌补体抗性的基因，大小为309 bp，在人源、禽源大肠杆菌中皆有发现。1979年，Binns等从人源大肠杆菌ColV、I-K94质粒获得iss基因表达，能显著增强含此基因大肠杆菌对1日龄雏鸡的毒力，还能增强转化菌的血清抗性[1-2]。目前，国外相关研究者大多将iss基因检测作为大肠杆菌毒力检测的参考指标之一，以1次PCR检测结果iss+或iss-来判定iss基因在大肠杆菌中的存在情况。大肠杆菌iss基因通常采用PCR方法或DNA探针方法检测，这2种方法检测结果可能出现不符合性，即某菌株PCR检测可能为iss+而探针检测为iss-，或PCR检测为iss-而探针检测为iss+[3-5]。而在实际应用中，多以PCR检测结果判定iss在大肠杆菌中的存在情况。本试验探讨PCR方法检测大肠杆菌iss基因缺陷的原因和改进方法，以提高PCR检测大肠杆菌iss基因的准确性。1材料与方法 　　1.1菌株及其来源 　　10株大肠杆菌，分别采自黑龙江省、山东省、贵州省、新疆维吾尔自治区、北京市等地的鸡场。 　　1.2引物合成 　　1.3酶类及主要生化试剂 　　蛋白酶K、RnaseA、rTaq酶、KOD酶、T4DNA连接酶、pMD19-T vector克隆载体及相关试剂，均购自宝泰克生物工程公司；DNA胶回收试剂盒，购自上海华舜生物工程有限公司；所用试验试剂均为分析纯。 　　1.4大肠杆菌DNA提取 　　将待测菌琼脂板划线分离，挑取平板上菌落直径2 mm的单菌落；加入40 μL裂解液（10 mmol/L Tris-Cl、pH值为7.5，1 mmol/L EDTA）和50μg/mL蛋白酶K，混匀；55 ℃温育10 min，再于80 ℃温育10 min，加80 μL灭菌三蒸水，-20 ℃保存。 　　1.5iss基因检测扩增反应体系 　　iss PCR扩增反应体系为：10×PCR buffer 5 μL、dNTP 4 μL、50 pmol/μL上游和下游引物各1 μL、大肠杆菌DNA模板5 μL、灭菌三蒸水33.5 μL，rTaq酶0.5 μL，共50 μL。套式PCR扩增反应体系为：10×PCR buffer 5 μL、dNTP 4 μL、50 pmol/μL 上游和下游引物各1 μL、大肠杆菌DNA模板 2 μL、灭菌三蒸水33.5 μL、rTaq酶0.5 μL，共50 μL。 　　1.6扩增反应程序 　　1.6.1rTaq酶PCR扩增反应程序97 ℃预变性5 min；97 ℃ 1 min、47 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s，9个循环；95 ℃ 1 min、48 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s，25个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。重复2次。对PCR扩增反应未得到目的片段的菌株进行套式PCR扩增反应，反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s、57.5 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，28个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。经连接转化，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。 　　1.6.2KOD酶PCR扩增反应程序97 ℃预变性5 min；97 ℃ 1 min、47 ℃ 1 min、68 ℃ 30 s，9个循环；95 ℃ 1 min、68 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s，25个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。重复1次。对PCR扩增反应未得到目的片段的菌株进行套式PCR扩增反应，反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s、57.5 ℃ 30 s、68 ℃ 30 s，28个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存