PCR膜杂交法CTUUNG三联检测在临床性病筛查中应用及与实时荧光PCR法比较研究.docVIP

PCR膜杂交法CTUUNG三联检测在临床性病筛查中应用及与实时荧光PCR法比较研究 　　【摘要】 目的：探讨PCR+膜杂交法CT/UU/NG三联检测在临床性病筛查中的应用价值。方法：分别采用PCR+膜杂交法和实时荧光PCR法检测CT、UU、NG，并分析比较两种方法的一致性以及相关性。结果：PCR反向膜杂交法和实时荧光PCR法的CT、UU、NG的筛查结果接近（P005），而男女筛查结果差异较大（P005）。结论：PCR反向膜杂交法操作简便，筛查快速、准确，有与实时荧光PCR法相当的检测准确性，具有较高的临床应用价值，值得在临床中推广应用。 　　【关键词】 膜杂交法； 人乳头状病毒； PCR法 　　选择我院于2010年1月～2012年10月期间行性病筛查的可疑患者717例，采用PCR联合膜杂交法对可以临床标本进行CT、UU、NG三项检测，旨在分析该检测法在临床性病筛查中的应用价值。现报道如下。 　　1一般资料与方法 　　1.1一般资料 　　对717例于我院泌尿外科、皮肤性病科、中医男科、妇产科中就诊的患者，同时进行了CT、UU、NG检测。其中，男性506例，女性211例。年龄在20～56岁之间，平均为345岁。女性患者有白带增多、阴道灼热、宫颈糜烂、瘙痒等症状；男性患者存在小腹疼痛、会阴部位坠胀、尿道炎等，或存在慢性前列腺炎。所有患者均无滴虫和真菌感染。 　　1.2仪器与试剂 　　人乳头状瘤病毒（HPV）分型检测试剂盒（PCR+膜杂交法），PE-480扩增仪，实时荧光定检测试剂盒，NG、UU、CT-PCR试剂盒，均由潮州凯普生物化学有限公司提供。 　　1.3PCR+膜杂交法 　　1.3.1标本的采集和处理采集女性标本时，在其宫颈口中插入无菌的棉拭子，并在宫颈口1～2cm处轻轻旋转20s左右，取其上皮细胞；采集男性标本时，将消毒棉拭子伸入到尿道中约1～2cm处，轻轻旋转10s左右，捻取尿道分泌物。采集到的样品均放入盛有1ml无菌生理盐水的试管中，加入2～3ml的漂洗液，并于12000转/min的离心机中离心约15min，重复清洗3次。然后在离心沉淀中加入50ul的DNA提取液，并充分摇匀，放入100℃的沸水浴中约15min，取出后再放入离心机中以15000转/min的转速离心10min，得出CT、NG、UU-DNA，各取4ul的上清液进行扩增处理。 　　1.3.2扩增反应以（标本数+2）作为扩增样本数n，取n×155ml的反应液，与n×1ul的Taq酶置于离心管中混合均匀后，在漩涡振荡器中震荡10s。然后以165ul分装，并于每管中加入1D石蜡油，将管密封备用。取35ul阴性对照液置于分装管中，并加入35ul的标本离心上清液，取出阳性对照标本，与5000转/min的转速下离心约2s，然后取出一个样本加入到一个反应管中。所有的标本以及阳性、阴性对照均需要在5000转/min的转速下离心约2s，然后取出并助于热循环仪上进行热循环35次，首先在37℃条件下反应10min，然后在94℃条件下保温约5min，然后在按照93℃保温45s、55℃保温45s、72℃保温60s，最后72℃时应延伸5min[1-3]。 　　1.3.3膜杂交反应 　　（1）DNA变性。加入20ul的DNA变形液于扩增过后的反应管中，充分摇匀，并置于室温下反应2min。（2）杂交。于酶板条的第一排孔中加入杂交缓冲溶液A 40ul，并按照顺序加入已经变性的DNA液10ul，充分摇匀，按照编号插入相应的杂交膜，于37℃的恒温箱中恒温，直至微孔中的杂交缓冲液A完全被杂交膜所吸干，这个过程大约需要5～10min。（3） 洗膜。于酶板的第二排孔中滴加杂交缓冲液B一滴，并按照序号将第一排空中的杂交梳插入到第二排的相应孔中，并于37℃的恒温箱中恒温，直至微孔中的杂交缓冲液B完全被杂交膜所吸干，这个过程大约需要7～10min。（4）酶结合。于酶板的第三排孔中滴加SA-AP一滴，并按照序号将第二排孔中安插的杂交梳插入到第三排的相应孔中，并与25℃下反应约7～10min，直至微孔中的工作液完全被杂交膜所吸干。（5）显色。于酶板的第四排空中分别滴加1D显色物液A以及 显色物底物液B，然后将其混合均匀，并将第三排孔中安插的杂交梳插入到第四排的相应孔中，在25℃条件下反应约5～10min，然后将杂交梳取出后判断结果。 　　1.4实时荧光检测 　　实时荧光定量检测：按照相关要求处理好标本洗涤液，以作为扩增反应的主要模板。按照试剂盒标注的要求，取适量已经处理好的标本加入到反应管中，并上机作PCR扩增。上机扩增条件根据配套试剂盒要求进行。结束反应后，由计算机进行自动数据分析和计算，以求得定量结果[3，4]。每次检测均应设定阴性、阳性以及空白对照。以试剂盒中给出的DNA的浓