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P13K―Akt信号通路在七氟醚预处理减轻大鼠脑缺血再灌注损伤中作用 　　摘要：目的 研究磷脂酰肌醇-3激酶-丝氨酸/苏氨酸激酶（P13K-Akt）信号通路在七氟醚预处理减轻大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用。方法 雄性成年SD大鼠40只，按随机法分为5组（n=8）：假手术组（C组）、缺血再灌注组（IR组）、七氟醚预处理组（S组）、七氟醚预处理+抑制剂LY294002 组（S+LY组）和溶剂组（DMSO组）。采用夹闭双侧颈总动脉法制备脑缺血再灌注模型，灌注24 h后取大鼠海马组织，光镜下观察各组的病理学变化，免疫组化法检测磷酸化的Akt表达，TUNEL法计算细胞凋亡指数（AI）。结果 与C组相比，其余4组AI、p-Akt指标表达均增加（P0.05），与IR组相比，S组AI表达降低显著（P0.05），p-Akt表达明显增加（P0.05），S+LY组及DMSO组AI和P-Akt表达差异无统计学意义。结论 七氟烷预处理可能通过激活PI3K/Akt 信号通路，减轻大鼠脑缺血再灌注损伤。 　　关键词：脑缺血再灌注；七氟醚预处理；磷脂酰肌醇3-激酶；蛋白质丝/苏氨酸激酶 　　中图分类号：R743 R285.5 文献标识码：A 　　doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2014.09.045 文章编号：1672-1349（2014）09-1120-02 　　脑缺血再灌注损伤可引起脑细胞凋亡。苏氨酸激酶/磷脂酰肌醇-3激酶-丝氨酸（P13K-Akt）是参与细胞增殖分化、抑制细胞凋亡，是细胞生存的一种重要信号通路之一[1]。研究表明，七氟烷预处理对脑缺血再灌注损伤具有保护作用，而这种保护机制尚不完全明确[2，3]。本实验研究P13K-Akt信号通路来评价七氟烷预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤中的保护作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验动物及分组 成年雄性SD大鼠40只，体重220 g～280 g（山西医科大学动物实验中心提供），按随机数字法，随机分为5组（n=8）：假手术组（C组）、缺血再灌注组（IR组）、七氟烷预处理组（S组）、七氟烷预处理+抑制剂LY294002（S+LY组）、溶剂组（DMSO组）。 　　1.2 模型制备及分组处理 采用夹闭双侧颈总动脉法制备脑缺血再灌注模型。大鼠称重，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，经口气管插管，接ALC-V8小型动物呼吸机（上海奥尔特生物科技有限公司）行机械通气，潮气量为（5～7）mL/kg，频率为60次/min，吸纯氧，流量为2 L/min，吸呼比1∶2。大鼠仰卧固定，颈前正中切开逐层分离，暴露双侧颈总动脉，然后用无创微动脉夹夹闭双侧颈总动脉20 min，松开动脉夹后恢复脑血流灌注，搏动恢复为建模成功。C组只分离双侧颈总动脉；IR组夹闭双侧颈总动脉缺血20 min，再灌注24 h；S组、S+LY组、DMSO组在缺血前60 min分别经七氟烷挥发罐（Aeommed vp3000）吸入2.4%七氟烷（sevoflurane，丸石制药株式会社）、2.4%七氟烷+侧脑室注入抑制剂LY294002（北京博奥森生物技术有限公司，溶于DMSO中，0.3 mg/kg）8 μL、侧脑室注入DMSO 8 μL，缺血20 min，再恢复灌注24 h。 　　1.3 标本采集 各组24 h灌注结束后取海马组织，置于10%甲醛固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜下（×400）观察各组病理学变化。 　　1.4 磷酸化Akt（p-Akt）的检测 采用免疫组化法（PV-6001二步法，试剂购于北京中杉金桥生物技术有限公司）检测p-Akt的活性（p-Akt多克隆抗体购于北京博奥森生物技术有限公司）。光镜下p-Akt阳性胞浆呈现黄棕色，每张切片随机选取5个视野，用图像分析系统计算平均光密度值（OD值），作为评价阳性产物指标。 　　1.5 细胞凋亡的检测 TUNEL法检测脑细胞凋亡，检测程序按照TUNEL试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）说明书进行。随机选取5个视野，计算阳性细胞数占总细胞数的百分比（阳性细胞细胞核呈现棕色颗粒），所得指数即为凋亡指数（AI）。 　　1.6 统计学处理 用统计学SPSS17.0软件分析，实验数据采用均数±标准差（x±s）表示，组间行单因素方差分析，两两之间采用SNK法，P0.05为差异有统计学意义。 　　2 结 果 　　2.1 大鼠脑细胞凋亡指数 AI及海马组织P-Akt表达 与C组比较，余4组凋亡指数AI及磷酸化Akt 表达均增加（P0.05）。与S组相比，S+LY组与DMSO组凋亡指数AI表达明显增加，磷酸化Akt表达降低显著（P0.05）。详见表1。 　　表1 大鼠脑细胞凋亡指数AI及海马组织P-Akt表达（x±s） 　　2.2 各