miR―21在增生性瘢痕成纤维细胞增殖及青蒿琥酯等药物作用下表达情况实验研究.docVIP

miR―21在增生性瘢痕成纤维细胞增殖及青蒿琥酯等药物作用下表达情况实验研究 　　[摘要]目的：研究青蒿琥酯抑制人增生性瘢痕成纤维细胞（HSFBs）增殖作用机制及miR-21所起的作用，为青蒿琥酯抑制皮肤瘢痕增生提供依据。方法：原代分离人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞，分别使用100、200、300、500 μmol/L的青蒿琥酯处理24h，采用CCK8检细胞的增值，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测miR-21的表达情况。调控青蒿琥酯干预的HSFBs中的miR-21的表达，通过qRT-PCR和WB检测细胞中结缔组织生长因子（CTGF）以及机制金属蛋白酶1（MMP-1）的表达。结果：青蒿琥酯能抑制HSFBs的增值，并且抑制miR-21的表达。HSFBs细胞使用mimics处理，能显著降低青蒿琥酯对HSFBs的增值抑制作用，同时CTGF的表达升高，而MMP-I的表达降低。结论：青蒿琥酯可能通过调控miR-21的表达来抑制HSFBs的增值。 　　[关键词]增生性瘢痕；成纤维细胞；青蒿琥酯；miR-21 　　[中图分类号]R619+.6 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2017）03-0080-04 　　皮肤增生性瘢痕是病理性瘢痕的主要类型之一，常常给人们带来瘙痒，病痛甚至活动障碍等多种并发症。降低了人类正常的生活质量，特别是形成于面部的瘢痕严重影响美观，给患者带来很大的精神压力。增生性瘢痕主要组织学特点是成纤维细胞的增加，细胞外基质的过度沉积以及胶原纤维紊乱无章的排列。 　　青蒿琥酯又称青蒿酯，是由菊科植物黄花蒿叶提取的倍半萜烯的一种内过氧化物。长期以来，人们一直用它作为一种治疗疟疾的传统中药。青蒿琥酯及其衍生物被世界卫生组织列为治疗疟疾的首选药物。它能特异性地抑制恶性疟原虫内质网钙腺苷三磷酸酶的活性。除了抗疟活性外，青蒿琥酯及其衍生物在一些自身免疫疾病模型中也表现出潜在的免疫抑制活性，例如：系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎和自身免疫脑脊髓炎。近年来，人们发现一定剂量的青蒿琥酯可以抑制HSFBs的增值，诱导其凋亡。 　　MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，大小约为20～25个核苷酸。miRNAs可调节细胞生长和组织分化，与生命过程中发育、疾病密切相关。有研究显示，miR-21能促进纤维化的发生，可以通过促进细胞外基质的沉积从而促进纤维化的出现。慕生枝等人指出，下调HSFBs中miR-21的表达可以抑制HSFBs的增值。本研究通过?w外培养HSFBs，采用不同浓度的青蒿琥酯进行干预，检测其对HSFBs增值的影响。同时通过抑制HSFBs中miR-21的表达，再一次验证青蒿琥酯对HSFBs的增值影响，探讨青蒿琥酯对HSFBs抑制作用可能的机制，为开发抗瘢痕药剂提供实验依据。 　　1材料 　　1.1主要仪器：TS-IOOF倒置显微镜，日本Nikon公司；全自动多功能型酶标仪，美国BIO-RAD公司，实时定量PCR扩增仪，美国ABI公司。 　　1.2主要试剂：青蒿琥酯，纯度99.99%，桂林南药股份公司；DMEM培养基、胎牛血清，美国Gibico公司；CCK8，美国Sigma公司；鼠抗人波形蛋白、鼠抗人CTGF单克隆抗体、鼠抗人Ⅰ型胶原多克隆抗体、鼠抗人GAPDH单克隆抗体，武汉博士德公司；RNA提取试剂盒，逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒，日本Takara公司；miR-21 mimics，上海吉码生物。 　　2方法 　　2.1 HSFBs的原代培养及鉴定：瘢痕标本来源于广州医学院附属第一医院烧伤整形科外科手术切除的增生性瘢痕，取材前经患者知情同意。组织采纳的标准为3年内没有接受抗瘢痕治疗，没有系统性疾病。采用组织块法进行原代培养。20%胎牛血清的DMEM培养基按照1：3反复传代纯化成纤维细胞。原代细胞、传代细胞均通过倒置显微镜进行观察。取3代成纤维细胞，制备细胞爬片，4%多聚甲醛固定，进行波形蛋白免疫组化染色鉴定。 　　2.2 CCK8检测HSFBs增值：细胞弃去培养液，用PBS洗涤细胞2次，弃去PBS，加入0.25%胰酶，在显微镜下观察，当胞质回缩，细胞之间不再连接成片，加入新鲜的完全培养基，制备细胞悬液；然后调整细胞密度至1×105/μl，取100 μl细胞悬液加入96孔板，即每孔种1×104个细胞，放入培养箱培养，常规培养；分别加入100、200、300、500μmol/L处理HSFBs，对照组加入培养基，继续培养24h。细胞处理结束的前4h，吸去培养液，按每lml完全培养基加入100 μl CCK-8将二者混合均匀后，每孔加入100 μl的CCK-8混合液，避免产生气泡，将培养板放到培养箱内孵育4h，4h后，将96孔板中的液体移至