三七总皂苷对人肺泡上皮细胞间质转化抑制作用.docVIP

三七总皂苷对人肺泡上皮细胞间质转化的抑制作用 　　[摘要] 该研究探讨了三七总皂苷对TGFβ1诱导的A549人肺泡上皮细胞间质转化和细胞外基质分解能力的影响。首先应用MTT法检测三七总皂苷对A549细胞增殖的影响，在12.5～200 mg?L-1，未发现三七总皂苷对A549细胞增殖有显著性的影响。接着将A549细胞分组。除正常组外，其余各组细胞应用5 μg?L-1TGFβ1刺激，其中TGFβ1组正常培养，其他刺激组分别用50，100，200 mg?L-1三七总皂苷干预。收集细胞和上清，先后采用圆形度值评估细胞的形态变化，免疫组化法检测特异性蛋白的表达以及酶联免疫吸附法检测MMP9和TIMP1的水平。TGFβ1刺激后，与正常组比较，细胞的形态发生变化，圆形度值显著减少（P0.01）；上皮特征性蛋白Ecad表达显著减少（P0.05）而间质特征性蛋白αSMA和FN的表达显著增加（P0.05）。与TGFβ1组比较，三七总皂苷干预能显著增加圆形度值、降低αSMA和FN的表达（P0.05，P0.01），但对Ecad的表达没有明显的影响。另外，TGFβ1刺激后，细胞分泌MMP9的能力显著增强（P0.05），而TIMP1的分泌量未见显著变化。与TGFβ1组比较，三七总皂苷增加MMP9的分泌量（P0.05），减少TIMP1的分泌量（P0.05，P0.01）。上述结果表明三七总皂苷能抑制肺泡上皮细胞的间质转化，促进细胞外基质分解，具有治疗肺纤维化的应用前景。 　　[关键词] 三七总皂苷；人肺泡上皮细胞；上皮间质转化；肺纤维化 　　特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是不明原因的间质性的肺泡纤维化，预后不良[12]。因此，有必要开展IPF药物的研究。目前认为肺泡上皮间质转化（EMT）是肺纤维化形成的一个重要机制，抑制EMT被认为是有效抑制纤维化的方法[35]。研究发现三七总皂苷对实验性的肺纤维化和肝纤维化有一定的抑制作用[67]，能明显抑制博莱霉素诱导的大鼠的纤维化肺组织中结缔组织生长因子的表达，可能影响肺纤维化的上皮间质转化病理过程[8]。因此，本研究以人肺泡上皮细胞株A549为研究对象，观察三七总皂苷对肺泡上皮间质转化的影响，进一步揭示三七总皂苷抑制肺纤维化的作用特点和途径。 　　1材料 　　1.1细胞株 A549细胞来自于中国科学院上海生命科学院细胞资源中心。 　　1.2药物与试剂 三七总皂苷由河南中医学院药学院冯素香教授提供。RPMI 1640培养基（Beijing Solarbio Science Technology Co. Ltd.）；胎牛血清（浙江天杭生物技术有限公司）；DMSO（Amresco）；MTT Formazan（Sigma）；Human TGFβ1（Pepro Tech Inc）。Ecad抗体，Fibronectin1（FN1）抗体，αSMA抗体，MMP9和TIMP1的酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒均为博士德生物有限公司产品。 　　1.3仪器 CO2培养箱，酶标仪（美国Thermo公司）；Olympus CKX41A32PH倒置荧光相差显微镜，Olympus C5060 Wide Room数码相机（日本Olypus公司）。 　　2方法 　　2.1细胞培养 用RPMI 1640完全培养基（含有100 U?mL-1penicillin，100 mg?L-1 streptomycin，5 958 mg?L-1HEPES和10%胎牛血清）于37 ℃，5%CO2培养箱常规培养A549细胞，细胞汇合达到80%之后，用0.25%胰蛋白酶消化，传代或进行有关试验。 　　2.2细胞增殖检测 根据文献[9]的MTT法检测药物对细胞增殖的影响。2.5×103的A549细胞加入到96孔板，培养24 h。吸出培养液，加入含有不同质量浓度（12.5，25，50，100，200 mg?L-1）的药物，以RPMI 1640完全培养液作为正常对照，继续培养48 h。加入MTT磷酸盐缓冲液，培养6 h后，吸出培养液，加入二甲基亚砜（DMSO）。490 nm波长检测吸光度。正常孔的平均吸光度作为100%，其他孔的吸光度除以正常孔的平均吸光度，乘以100%，作为每孔的生存率。 　　2.3TGFβ1诱导EMT以及分组 取24孔培养板，每个孔中加入玻璃片（爬片），在爬片上加入100 μL的1×104细胞。静置2 h后，每孔加入900 μL的不含血清的培养液，饥饿8 h。更换培养液并随机分组，即正常组（1 000 μL完全培养液）、TGFβ1组（1 000 μL含有5 μg?L-1 TGFβ1的完全培养液）、3个剂量的药物干预组（1 000 μL含有5 μg?L-1TGFβ1的完全培养液，并