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不同山楂品种亲缘关系的RAPD分析 　　摘要：为探讨山楂品种间的亲缘关系，采用RAPD技术对20个不同品种的山楂材料进行了基因组DNA多态性分析。从120个引物中筛选出15个10bp的随机引物对所选山楂品种的DNA样品进行PCR扩增，共得到216条谱带，177条表现多态性，多态性比率达81.9％，其中包含27条特异性谱带，揭示了山植植物丰富的遗传多样性。且利用NTSYS软件和UPGMA法对扩增结果进行了品种间相似系数的计算及聚类分析，结果表明相似系数在0.71～0.87，实生楂与其他山楂品种亲缘关系较远。 　　关键词：山楂；亲缘关系；RAPD 　　中图分类号：S661.5 　　文献标识码：A 　　文章编号：1009―9980(2009)05―729―4 　　 　　山楂(CrataegusL.)属蔷薇科苹果亚科植物，是起源于我国的特产果树。山楂品种资源丰富，经过长期栽培和选择形成了丰富的变异类型。由于某些山楂品种的形态学性状很相似，所以同名异物和同物异名现象十分普遍。我国山楂资源研究至今多是通过常规方法对其进行评价鉴定，关于分子水平的研究报道不是很多。山东地区山楂资源丰富，在分子水平针对山东山楂的研究尚未见报道。郭太君等利用过氧化物同工酶酶谱将山楂分为大山楂、伏山楂、秋山楂、软籽山楂和黄果山楂5个品种群，并对伏山楂和黄果山楂植物分类地位以及品种群间的亲缘关系进行了探讨。 　　Welsh等和Williams等利用PCR技术发展起来RAPD技术，RAPD具有技术简单、检测速度快、只需少量DNA样品、不依赖于种属特异性和基因组结构、一套引物可用于不同生物基因组分析和成本较低等优点，在桃、樱桃、苹果、杏、梨、葡萄等多种果树中得到广泛应用。但是，RAPD技术应用于山楂的研究还极少。代红艳等对5个野生类型和30个大果类山楂栽培变种进行了RAPD分析，指出野生类型与栽培品种间的亲缘关系较远。同时也证明了RAPD技术应用于山楂品种间的亲缘关系是可行的。我们选取了山东省临沂市的20个品种进行了RAPD-PCR分析，并构建了遗传树状图对山楂不同品种间的亲缘关系进行了研究，旨在丰富该组植物系统学研究内容，为我国山楂种质资源的分子生物学方面的研究提供依据。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1.1　材料 　　采集20份山楂材料嫩叶(表1)，时间为2008-年4月初，地点是山东省临沂市，将样品贮于80℃的超低温冰箱中备用。 　　 　　 　　1.2　总DNA提取与测定 　　取各品种嫩叶，采用CTAB法提取总DNA，考虑到多年生果树富含多糖和酚类物质的特性，在提取缓冲液中加入3％的PVP和2％的B－巯基乙醇。采用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度，测定DNA在260nm和280nm下的吸光值确定其纯度，于-20℃冰柜中保存备用。 　　 　　1.3　引物筛选 　　参照北京赛百盛SBS公司的引物序列，选取120个引物对少数山楂品种的DNA样品扩增。从中筛选出扩增性强、重复性好、多态性高的15个引物(表2)，用于全部山楂品种DNA样品的扩增。 　　 　　1.4　PCR扩增及产物的鉴定 　　由于RAPD反应条件在物种间的较大差异性。本试验摸索了一套专门适合山楂PCR扩增的程序。PCR的反应体系如下，20μL总体积中含不少于50ngDNA模板，引物(10mmol?L-1)1.6μL，dNTP(10mmol?L-1)0.5μL，10×Taqbuffer(含MgCl2)2μL，TaqDNA聚合酶(2.5U?μL-1)0.5μL，ddH2O13.4μL。扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性45s、34℃退火45s、72℃延伸1min，40个循环，最后72℃延伸5min。PCR扩增反应结束后，在1.4％的琼脂糖凝胶中电泳检测。并且实验用dNTP、10×Taqbuffer、TaqDNA聚合酶均购自TIANGEN公司，实验用品的统一性确保了扩增的稳定性。 　　 　　1.5　数据统计与分析 　　电泳图谱中的每一条带均代表了引物与模板DNA互补的一对结合位点，可记为一个分子标记，并估计扩增产物的分子量大小。将有带的记为1，无带的记为0，形成0、1矩阵图输入计算机。采用NTSYS-pc2.10e软件分析了不同山楂品种的RAPD扩增数据，得到品种间的相似度系数矩阵。根据UPGMA方法构建聚类树状图。 　　 　　2　结果与分析 　　 　　2.1　DNA多态性分析 　　表2列出了不同引物的碱基序列及其对不同山楂品种扩增反应的结果。从120个随机引物中选出15个引物对20个山楂品种的DNA样本进行PCR扩增，结果表明扩增的产物谱带从9条(AS7)到23条(A4)不等，平均每个引物产生14条带，共产生216条扩增产物带