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不同微生物菌株发酵猪血的研究 　　摘要：目的：针对13种不同微生物发酵猪血，研究选出最优菌不同配比的水解效果。方法：凯氏定氮及甲醛滴定法。结果：最优三种菌株的不同配比为1%乳S，1%啤酒酵母，0.5%枯草配比组合发酵猪血水解效果最佳。 　　关键词：猪血蛋白；水解度；配比 　　基金项目：长春市科技局项目（2012223） 　　中图分类号：TS201.3文献标识码：ADOI编号：10.14025/j.cnki.jlny.2015.10.030 　　猪血是一种高蛋白、低脂肪、低糖且微量元素含量丰富的肉类工业副产品[1]，其蛋白含量与猪瘦肉相当[2]，故有液态肉之称[3]。我国是世界上养猪最多的国家，每年存栏数至少在3亿头以上，因此，每年可利用的猪血量达到90万吨，数量相当可观[4]，然而，我国许多屠宰场屠宰牲畜后留下来的血液除了少部分用作菜肴食用外，绝大多数就直接排放到环境中，既浪费了宝贵的蛋白质资源，又严重污染了环境。目前，利用蛋白酶水解猪血制备多肽研究居多，多数采用单一酶或者混合酶进行酶解。少数采用微生物降解猪血。枯草芽孢杆菌能够产生蛋白酶，具有丰富的产酶系统，具备生产多种酶的应用[5～8]。近年来，枯草芽孢杆菌及微生物群体之间相互作用，由于不同的代谢途径，产生代谢产物不同，微生物协同作用能优势互补，相辅相成起到单一菌株起不到的作用[9]。微生物产酶促进蛋白质分解、转化，并积累大量的代谢产物[10]。通过微生物发酵法为猪血蛋白质资源在饲料行业高效利用创造良好条件，又能解决猪血废弃物带来的环保问题。 　　本试验利用6种乳酸菌；2种芽孢枯草杆菌；5种酵母菌进行猪血发酵实验。选出最优菌的不同配比水解效果，为后续的猪血发酵蛋白水解实验提供依据。 　　1材料与方法 　　1.1原料、试剂材料及仪器 　　1.1.1原料 　　猪血：由华正集团提供。 　　乳酸菌：乳完、乳S、北1、乳M、长1、乳G；酵母菌：啤X-33、啤酒酵母、酵母Q、酵母b、酵母假P；枯草芽孢杆菌：枯草、枯草1，由吉林农业大学生物工程实验室提供。 　　1.1.2试剂硫酸铜、氢氧化钠、吐温80、牛肉膏、蛋白胨、乙酸钠、磷酸氢二钾、甲醛等。 　　1.1.3仪器HYG-A全温摇瓶柜，大仓市实验设备厂；立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；超净工作台，苏州真田洁净设备有限公司。 　　1.2实验方法 　　1.2.1指标测定蛋白质水解度的测定：采用半微量凯氏定氮法[11]；可溶性蛋白含量的测定：采用考马斯亮蓝法；氨基酸态氮含量测定：采用电位甲醛滴定法[12]；水解率用甲醛滴定法测氨基酸含量。 　　1.2.2实验菌株的摇瓶培养 　　1.2.2.1三种菌株培养基的配置 　　配制600毫升MRS培养基、300毫升YEPD培养基及肉汤培养基，将制备好的培养基放入灭菌锅内，120℃灭菌20公钟备用。 　　1.2.2.2菌株平板培养在超净工作台里倒平板，做好标记，冷却后将对应菌株涂布接种到培养基上，在各自最适温度下培养2～3天。 　　1.2.2.3各菌株的摇瓶培养从固体平板培养基上挑取菌落接种到新配好的液体培养瓶中，将接种好的菌液放入32℃每分钟120rpm的恒温摇床中震荡培养2天。 　　1.2.3菌株接种发酵及发酵液水解度测定 　　单菌种发。将培养好的各菌液按接种量5%接种到50毫升的猪血中，做好标记，放入32℃每分钟120rpm的恒温摇床中培养60小时。 　　1.2.4三种混合菌株混合发酵 　　1.2.4.1三种菌株不同浓度配比正交实验 　　按表1-1中三因素两水平的正交试验方案设计4个处理，接种到猪血中，在32℃每分钟120rmp的恒温摇床中震荡培养。48小时后测水解度。 　　1.2.4.2不同时间对三种混合菌发酵水解度的影响 　　在32℃每分钟120rmp的恒温摇床中震荡培养，设定三个时间36小时、48小时、60小时、测混合菌株发酵液的水解度。 　　2结果与分析 　　2.1单菌种发酵水解度的比较 　　将所用的每种菌种接种到50毫升的猪血中。在相同的条件下32℃每分钟120rpm的恒温摇床上培养。用甲醛法测其发酵液中氨基氮的含量从而计算出水解度（见表2-1）。 　　从表2-1数据可以看出每种属中水解度依次为乳S北1乳完长1≥乳M乳G，枯草枯草1，啤酒酵母≥啤X-33酵母b酵母Q≥酵母假P。最高的菌株是乳S、枯草、啤酒酵母、啤X-33。因为考虑到啤酒酵母具有去除猪血异味的作用，因此在后面的实验中选取啤酒酵母。 　　2.2三种混合菌株发酵水解度的比较 　　三种菌啤酒酵母，乳S，枯草根据表1-1中的配比进行混合发酵，在48小时测其水解度，数据见下表2-2所示。 　　由表2-2数据分析可知，在3个菌株中，根据极差R啤酒酵