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不同时程低氧暴露对大鼠髓源性细胞HIF―1α与hGlyrichin表达影响的研究 　　山东体育学院学报第30卷第6期2014年12月 沙继斌，等不同时程低氧暴露对大鼠髓源性细胞HIF-1α与hGlyrichin表达影响的研究No.6 2014已有研究证明低氧应答的核心元件HIF-1α与机体固有免疫机能存在密切联系，HIF-1α表达上调可激活血液中的髓源性细胞使固有免疫应答增强[1]，并可上调抗菌肽的表达；HIF-1α的增效剂含羞草碱[2]及近期报道的HIF-1α稳定剂AKB-4924[3]自身并无抗菌活性，但可以通过提高胞内HIF-1α表达以增强巨噬细胞与上皮细胞的抗菌活性，有效抑杀具有甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌。hGlyrichin是近年来发现的富含甘氨酸的新型抗菌肽家系的重要人源性成员，其结构及抗菌活性已得到初步确证[4-5]。本研究尝试同步观察不同时程低氧暴露对HIF-1α表达及hGlyrichin表达的影响，为分析二者之间的可能联系提供实验依据。 　　1材料与方法 　　1.1实验动物雄性Wistar大鼠60只，体重207±11.4 g，购自军事医学科学院实验动物中心（动物许可证号：SCXK（军）2007-004），随机分为对照组、低氧12、24、36、48、72小时组，分笼常规饲养，自由饮水、进食。采用hypoxico系统模拟海拔2500米常压低氧环境以进行间歇性低氧暴露，每日2小时。累计低氧暴露时间分别为12、24、36、48、72小时后，尾静脉收集静脉血，肝素抗凝，以淋巴细胞分离液分离去除淋巴细胞和单核细胞，然后用右旋糖酐（dextran） 沉降与低渗法去除红细胞，从而得到纯度较高的多形核白细胞，-80℃保存以备指标测定。 　　1.2主要试剂淋巴细胞分离液（购自Gibco），Trizol（购自Invitrogen），RT-PCR试剂盒（购自Promega），丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、SDS（购自Sigma），HIF-1α抗体（购自Abcam），IPG胶条及buffer（购自Bio-rad），常规试剂均为国产分析纯 　　1.3引物序列hGlyrichin上游引物： 5’-CGCATGCCGGTGGCCGTGGGT-3’， 下游引物：5’-CCGTTAGCATCGGATGCCCAT-3’；HIF-1α上游引物：5’-CTTTCTTGGAAACGAGTGAAAGG-3’，下游引物：5’-TGAGTAATTCTTCACCCTGCAG-3’；G3PDH上游引物：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’；均由英骏公司合成。 　　1.4实验方法 　　1.4.1RNA提取以1‰DEPC水处理所有提取RNA用品，用Trizol裂解液按照《分子克隆指南》RNA提取方法从多形核白细胞中提取RNA，所有离心操作均在4℃冷冻离心机中进行，收集RNA沉淀后在无菌操作台中风干，而后将沉淀溶于20 μl 去离子水，琼脂糖凝胶电泳鉴定所提取RNA。 　　1.4.2RT-PCR 　　1.4.2.1逆转录取所提取RNA10μg与Oligod（T）1 μl混匀后，65℃水浴10 min后迅速置于冰上冷却5 min，按照如下反应体系依次加入下列试剂：RNA酶抑制剂3 ul，AMV RT5×Reactiong Buffer1 ul，100mM DTT1ul，10mM dNTP 4ul，AMV反转录酶1ul，1‰ DEPC 水加至总体积为20 ul，混匀后置于42℃恒温箱中反应1 h，取逆转录产物cDNA 2 μl作为PCR模板，同时以G3PDH作为内参。 　　1.4.2.2PCR逆转录所得cDNA2ul，hGlyrichin/HIF-1α上游引物0.5 ul，hGlyrichin/HIF-1α下游引物0.5 ul，G3PDH上游引物0.5 ul，G3PDH下游引物0.5 ul，2.5 μM dNTP4 ul，10×PCR缓冲液2 ul，rTaq酶0.5 ul，ddH2O加至总体积为20 ul；95 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min，56℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min，共32个循环，72 ℃延伸7 min，琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR结果。 　　1.4.3Western BlotSDS结束后取下凝胶，在电转仪中与预处理过PVDF膜按次序叠放好，采用半干法转膜，电压12 V，转膜30 min；将电转后的膜在2.5%脱脂牛奶中室温封闭2 h；TBS冲洗3次，5 min/次；用TBS按1：3000稀释兔源HIF-1α一抗，与PVDF膜作用2 h；TBST冲洗3遍，每次15 min；用TBS按1：5000稀释HRP标记羊抗兔二抗，与PVDF膜作用