中医干预对艾滋病免疫重建不全患者TCRVβ基因CDR3区克隆片断影响.docVIP

中医干预对艾滋病免疫重建不全患者TCRVβ基因CDR3区克隆片断的影响 　　[摘要] 目的：探讨中医干预对艾滋病免疫重建不全患者TCRVβ基因CDR3区克隆片断的影响。方法： 以15例HIV抗体阴性健康献血员做对照，采集37例艾滋病免疫重建不全患者治疗前后的外周血PBMC，采用人类TCRVβ基因CDR3多样性定量检测试剂盒检测，基因扫描作图并计算Vβ家族中每个家族不同大小CDR3 区片段的分布。结果：对比正常人，患者一些Vβ内出现了明显的CDR3 区的单寡克隆扩增情况，治疗后各家族单寡克隆情况有不同程度的改善和恢复。其中9，11，21，22 4个家族的D值2组治疗后均比治疗前下降，治疗组下降幅度较对照组在21，22 2个家族更为显著（P0.05）。治疗组显著降低第18家族D值，而对照组则显著增加（P0.05）。结论：中药复方对于TCRVβ各家族单寡克隆情况有不同程度的改善和恢复，提示中医药可能促进T细胞部分受体基因重排，丰富受体库，帮助机体免疫细胞有效识别病毒，减少T细胞凋亡。 　　[关键词] 艾滋病；免疫重建不全；TCRVβ；免疫2号方 　　TCRVβ基因是免疫研究的一个热点，通过分析TCRVβ的基因谱系和CDR3长度和序列，可以精确地分析不同TCRVβ亚家族T细胞的基因表达和克隆性，是目前分析T细胞克隆性最为敏感的方法[1]。该方法能够很好地对HIV/AIDS患者外周血T细胞TCRVβ亚家族的表达和克隆性进行分析，从而深入了解机体的免疫功能和对HIV相关抗原的特异性免疫反应情况。近年来有研究证实中药免疫2号方联合HAART能够有效提高患者免疫功能，促进免疫重建，本研究对TCRVβ基因亚家族多样性的改变进行检测，初步探索该疗法对机体免疫调节的作用机制。 　　1 材料 　　1.1 临床资料 37例艾滋病免疫重建不全患者均来源于广西柳州龙潭医院，均为HIV抗体阳性，经Western Blot确认试验证实，经HAART治疗12个月以上，病毒载量控制良好，CD4+T细胞计数上升不足100个/μL的患者。另选取性别、年龄相匹配的15例HIV抗体阴性健康献血员为对照组，来源于广安门医院体检中心。 　　1.2 药物 37例患者随机分为2组，一组按照前期服药方案继续给予国家标准HAART治疗方案，即AZT（d4T）+3TC+NVP（EFV），并联合使用中药免疫2号方（四川新绿药业有限公司生产并提供），6.2 g/次，早、晚餐前0.5 h冲服。30 d/周期，连续治疗6个周期。 　　1.3 主要仪器和试剂 生物安全柜（Class Ⅱ，美国NuAire 公司），台式高速离心机1-15K（德国Sigma 公司），涡旋振荡器（IKA-MS1/MS2，IKA 公司），可调移液器（Eppendorf公司），FACS Calibur流式细胞仪及MultiTEST软件自动分析数据（美国BD公司），定量PCR仪（ABI 7500 FAST），3700测序仪（ABI）。TCR Express Human T Cell Receptor Vβ Repertoire CDR3 Diversity Determination and Quantitative Analysis Kit（美国BioMed Immunotech公司），人淋巴细胞分离液（国产，天津川页），TRizol试剂（Invotrigen），RNA抽提试剂盒（Qiagen），RNA逆转录试剂盒（Invotrigen）；Taq Polymerase（Invotrigen），RNA酶抑制剂（epicentre），RNeasy MinElute纯化试剂盒（Qiagen）。 　　2 方法 　　2.1 样本采集及外周血单个核细胞（PBMC）分离 抽取受试者5 mL外周血，EDTA 抗凝，无菌条件下Ficoll液常规方法分离PBMC，每管加入0.5 mL Trizol 试剂，充分抽打、混匀，置于-80 ℃以下保存。运输样品时严格控制运输的冷冻状态，防止样品冻融。 　　2.2 提取细胞总RNA 用Qiagen公司的RNA抽提试剂盒提取细胞总RNA，依试剂盒说明操作。取3 μL跑胶鉴定。 　　2.3 RNA逆转录 用Invtrigen公司的RNA逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，依试剂盒说明操作。 　　2.4 巢式PCR扩增TCRVβ基因 2轮PCR 按照如下程序进行：Plate I PCR 扩增条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环，72 ℃ 5 min，4 ℃。Plate II PCR 扩增条件：95 ℃ 3 min，95 ℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25个循环，72 ℃ 5 min，4 ℃。对第2轮