乳鼠心肌细胞培养方法.docVIP

乳鼠心肌细胞的培养方法 　　摘要细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出,模拟动物体内的生理条件,在体外进行培养.使其不断地生长、繁殖,人们借以观察细胞的生长、繁殖;细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。对乳鼠心肌细胞的培养进行理论和实验探讨。 　　关键词乳鼠心肌细胞;细胞培养;方法 　　中图分类号R3文献标识码A文章编号1673-9671-(2010)061-0115-01 　　 　　1材料 　　所需液体:Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、双抗液、碳酸氢钠液、盐酸液。 　　试剂:Trypsin,SDS,DMEM均购于SigmaChemicalCo.小牛血清购于杭州四季青生物制品有限公司,其余均为国产分析纯。 　　取鼠:标准SD大鼠,鼠盆用棉铺好,取鼠。 　　物品:白大衣、饭盒;小剪子、小镊子(4套)(一套剪皮肤、一套开胸取心,一套剔除心缘纤维组织,一套剪碎心脏);瓶皿(2套);250ml烧杯3个;500ml烧杯1个,用作废液缸;50ml烧杯3个(剪碎心肌组织,最后配液);三角烧杯(50ml)小转子(小转子,酒精擦,双蒸水冲后,再把酒精彻底冲掉后用三角烧杯高压);离心管及帽(12-14个),两个试管;吸管(5-8个)大镊子(两把,持物,例夹棉球等);台面:磁力搅拌器、纱布(事先用于托盘装0.1%新洁尔灭浸泡)、试管架、泡沫塑料板、五个针头(不用消毒)75%酒精棉球及碘酒(消毒棉球,泡酒精、碘酒)大镊子两把(一把夹棉球,一把取鼠)、3个250ml烧瓶(一个装一蒸水,一个装新洁尔灭,另一为空的备用)1个500ml烧瓶(废液缸)、温度计、PH试纸(事先调PH值)、酒精灯、打火机/火柴、载玻片(5-10个)、注射器5ml6个(胰酶、DMEM、小牛血清)1ml2个(双抗液)20ml备用2个、微量加样器1000ml及500ml。 　　以上物品均用紫外线照30分钟。 　　另外准备手套、帽子、口罩、24孔培养板、离心机、未冻药品及DMEM、HCL、NaHCO3、小牛血清。 　　事先把显微镜、离心机、磁力搅拌器电源插好。检查酒精灯是否有酒精,碘酒和酒精棉球是否够用。先把物品递入,后穿大衣、帽子和口罩。然后把酒精灯打开,把瓶皿摆好,再用一个瓶皿装酒精棉球。 　　2培养方法 　　乳鼠心肌细胞属于原代生长细胞,培养过程较为繁琐。文献上有多种浓度胰酶消化方法,我们在试验中摸索到0.06%浓度的胰酶对细胞损害较小,比起一些文献记载的0.15%浓度有一定的优越性,但这个浓度消化所需时间较长,所以我们又采取多次反复低浓度消化的方法,每次消化一些后,用吸管抽取出上清液,离心所得即为心肌细胞。利用心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同,采用差速贴壁1h,除去成纤维细胞,达到纯化的目的。成纤维细胞胞体呈梭型或不规则三角形,中央有卵圆形核,胞质突起,生长时呈放射状。 　　事先检查显微镜、磁力搅拌器及离心机是否好用,提前三小时把小牛血清、胰酶、抗生素拿出来化开。其余未冻药品也提前20分钟拿出来缓和一下。新洁尔灭(0.1%)泡纱布(用10ml5%的新洁尔灭加水至500ml即得),消毒地面(1:500的84液),用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好,开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。 　　具体方法: 　　1)把两个5ml注射器分别插入DMEM和胰酶中,分别向两个圆皿中加入5ml的DMEM培养液。用一把大镊子从鼠盆里取出一只生后2-3天的SD大鼠,放入0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出放在泡沫板上,用针头把鼠固定(位置摆正),用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤,再用酒精棉球脱碘,取一把小剪子及小镊子开皮,充分撕拉开,再用酒精棉球消毒,后换另一把小剪子和镊子在剑突处正中线稍偏左开胸取心。 　　2)取出的心放在刚才准备的一个装有DMEM的圆皿中再取下一只。重复以上过程。(鼠全部杀死后,把取鼠镊及泡沫板、新洁尔灭缸等拿出台面。消毒、清洁,铺纱布、换手套。 　　3)用第三副剪子和镊子把圆皿中的心脏周边的血凝及纤维组织剔除掉,放在另一个预先装好DMEM的圆皿中。抽取5ml的胰酶,然后将其中少许放入50ml的小烧杯中,大部分倒入三角烧瓶中。用第四副剪子将烧杯中的心脏剪成1mm3的碎块,倒入三角烧瓶中(可用剪刀刮入),再用剩余胰酶刷净烧杯。 　　4)把温度计和三角烧杯放入250ml烧瓶中,(事先调好水量,多会没过三角烧杯,少温度会不均匀)。打开磁力搅拌器电源,调温度(使-缓慢加到34-35℃)和转速(转速不可过快,否则会打碎细胞,基本上标志为平行)。一定要注意监控。 　　5)温度达到34℃时开始计时,第一次为10分钟,以后可为8分钟,事情况而定。在此期间,在试管架上摆上5、6个离心管,标上1、1,2、2。其中在