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云南松毛虫肠道中产脂肪酶菌的研究 　　摘要：采用微生物筛选培养和酶学方法，研究了云南松毛虫肠道内产脂肪酶菌群及产酶特性，为松毛虫的综合开发利用提供理论依据。结果表明，从云南松毛虫幼虫肠道内共分离筛选获得193株产脂肪酶的菌株，涉及3个菌属：82株假单胞菌属（Pseudomonas）、67株芽孢杆菌属（Bacillus）和44株克雷伯氏菌属（Klebsiella）；其中，假单胞菌属为优势菌群，占总菌株数量的42.49%；供试的9株菌株表现出不同的产脂肪酶活性，并从中筛选得到了1株高产脂肪酶菌株P-50，最适作用温度为35 ℃，pH值为8，经发酵至60 h时生长量达到最大，在48 h左右时酶活性达到最高；P-50初步确定为中温产碱性脂肪酶菌。 　　关键词：云南松毛虫；产脂肪酶菌；酶活性；假单胞菌属 　　中图分类号： Q814文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2017）10-0093-03 　　近年?恚?随着胃肠道微生态理论的深入研究，有关昆虫肠道微生物的研究已成为新热点[1-2]。脂肪酶是一类特殊酯键水解酶，广泛存在于动植物组织微生物体中，其中发现能产脂肪酶的细菌约有28个属[3-4]。目前，已在多种昆虫肠道中发现各类产酶菌群，并对酶学性质进行了研究，昆虫肠道中存在不同功能的菌群[5-8]。由于微生物脂肪酶作用的温度和pH值范围比动植物脂肪酶的更宽，易获得较高纯度酶制剂，适合于工业上大规模生产[9-10]。因此，不断筛选出具有新特性和高活性的脂肪酶是一项非常有意义的工作。 　　云南松毛虫（Dendrolimus houi Lajonquiere）属鳞翅目（Lepidoptera）枯叶蛾科（Lasiocampidae），是林业的重大害虫之一，但是从营养学和资源学的角度来看，它又具有极大的开发利用价值[11-12]。目前国内外对松毛虫的研究主要集中在防治方面，且在相关产酶微生物资源研究时，多从土壤、淤泥中分离筛选，但对松毛虫的利用以及肠道微生物的研究报道较少[13]。由于松毛虫长期食用多种松类针叶，对松油脂有着特殊的消化体系，可能肠道内存在着特殊的微生物菌群资源[14-15]。因此，本研究拟以云南松毛虫为试验材料，研究松毛虫肠道内产脂肪酶菌株及酶学特性，为松毛虫的综合利用及产脂肪酶微生物新资源的开发提供科学依据。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　1.1.1云南松毛虫 　　采自云南省楚雄州永仁县云南松母树林，共计60只幼虫。 　　1.1.2培养基 　　试验培养基名称及配方[16]。分离培养基：肉膏5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、NaCl 5 g/L、琼脂15.0 g/L，pH值=7.0；脂肪酶筛选培养基：牛肉膏5.0 g/L、蛋白胨 10.0 g/L、橄榄油20.0 mL、琼脂15.0 g/L，pH值=7.0；活化培养基：牛肉膏5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、橄榄油20.0 mL、琼脂15.0 g/L，pH值=7.0；高产脂肪酶菌株筛选培养液：酵母膏5.0 g/L、（NH4）2SO4 5.0 g/L、K2HPO4 2.0 g/L、MgSO4?7H2O 0.5 g/L、NaCl 3.0 g/L、橄榄油20.0 mL、云南松节油 20 mL，pH值=7.0；发酵培养基：酵母膏5.0 g/L、（NH4）2SO4 5.0 g/L、K2HPO4 2.0 g/L、MgSO4?7H2O 0.5 g/L、NaCl 3.0 g/L、云南松节油20 mL，pH值=8.0。 　　1.2试验方法 　　1.2.1产脂肪酶菌株的分离筛选及分子鉴定 　　用无菌水饲养云南松毛虫1 d后，解剖虫体取其肠道，经研磨、稀释后涂布于分离培养基上，37 ℃培养48 h。挑取形态各异的纯菌落接种到脂肪酶筛选培养基进行培养，筛选能产生透明圈的菌株。对菌株进行DNA提取[细菌DNA提取试剂盒，生工生物工程（上海）股份有限公司]，采用16S rDNA通用引物进行16S rDNA序列的扩增和测序分析。计算分离率及分离频率。 　　[JZ]分离频率=a/b×100%。 　　式中：a为分离到的某一指定类型真菌的菌株数量，株；b为分离的真菌菌株数量，株。 　　[JZ]分离率=a/c×100%。 　　式中：a为分离到的某一指定类型真菌的菌株数量，株；c为分离样品总数，60只。 　　1.2.2高产脂肪酶菌株筛选 　　从假单胞菌属、芽孢杆菌属、克雷伯氏菌3个菌属中分别选取3株供试菌株筛选高产脂肪酶，分别为P-13、P-50、P-106；P-03、P-19、P-154；P-06、P-28、P-67。将这9株供试菌株分别接种于高产脂肪酶菌株筛选培养液中培养（以云南松节油为底物，橄榄油作对照底物），48 h后测定脂肪酶活