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代谢性标记结合二维电泳寻找O―糖基化蛋白的研究 　　摘 要：蛋白质的o-糖基化（O-glycosylation）是一种重要的翻译后修饰，参与诸多生理和病理过程。目前，对于蛋白质的O-糖基化的研究进展仍非常缓慢，一个重要的原因就是缺乏高效的对O-糖基化蛋白进行分离和鉴定的技术。创新性地将点击化学反应、二维电泳和质谱技术结合，对寻找细胞内0-糖基化蛋白进行了技术探索性研究。首先利用代谢性标记手段，在人肝癌细胞HCCLM6培养基中加入四乙酰化叠氮半乳糖胺（Ac4GaINAZ）对细胞内O-GalNAc糖基化蛋白进行标记：其次通过点击化学将炔基荧光基团连接至标记的O-糖基化蛋白的叠氮基团；应用二维电泳技术对标记蛋白进行分离，并找到13个具有荧光信号的蛋白点；最后对具有荧光信号的蛋白进行质谱鉴定，成功鉴定到7种蛋白，经软件预测后，GRP78蛋白和ANXA1蛋白均具有潜在的0-糖基化位点。这为寻找细胞或生物体中的O-糖基化蛋白奠定了基础，并为高通量筛选O-糖基化蛋白提供技术平台。 　　关键词：O-糖基化蛋白；点击化学；二维电泳；质谱技术 　　中图分类号：Q599 　　文献标识码：A 　　文章编号：1007-7847（2014）05-0377-05 　　糖基化是一种常见的蛋白质翻译后修饰，存在于生物体内超过一半的蛋白质中。糖基化修饰对于蛋白质的结构和功能具有显著影响，参与调节信号传导、分子转运、细胞粘附、免疫应答等牛物学过程.除此之外，异常的糖基化修饰与诸多疾病有密切关系，粘蛋白型O-糖基化是一类广泛仔在的蛋白质糖基化修饰，其合成的第一步为：UDP-乙酰氨基半乳糖（UDP-GalNAc：，供体）通过多肽N-乙酰氨基半乳糖基转移酶（pp-GalNAc-Ts）的催化连接在蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基（受体）的羟基氧上。由于缺少保守的O-糖基化氨基酸特征序列，缺乏通用的糖苷酶以及O-糖链结构的复杂性等原因，目前对于蛋白质O-糖基化的分析仍处于方法开发阶段。生物正交点击化学（bioorthogonalClick chemistry）可经简单的叠氮一炔基环化加成反应将含炔基检测标签共价连接到生物兼容的叠氮标记的待测分子上。凭借其生物相容性、生物正交性、高效性和高特异性等优点.此类新兴技术在化学糖生物学领域发展迅速[10，11]。基于叠氮的生物正交点击化学在糖生物学研究中的应用，主要分为以下几个方面：1）在糖代谢过程中的应用。在糖代谢研究的早期.Reutler教授开发了代替唾液酸的非天然N-酰基类似物，为唾液酸的研究提供了新思路。近10年来.Bertozzi教授利用施陶丁格反应进行糖代谢的研究，进一步推动了生物正交点击化学的发展：2）在糖链活体成像中的应用。目前，AC4ManNAz，AC4GalNAz和GDP-FucAz均成功地应用于糖链活体成像研究中；3）在糖链富集和糖组学中的应用。 NarimatsU教授将生物正交点击化学与质谱技术结合，成功的鉴定出岩藻糖基化的N -聚糖位点图谱。此外，本课题组开发的一种以二硫键和末端炔基修饰的二氧化硅纳米颗粒，可从多肽混合体系中特异性地富集叠氮标记的多肽：4）在病毒研究中的应用。可用叠氮或炔基修饰病毒表面.有利于成像和药物传送；5）另外，生物正交点击化学在蛋白活性表达谱，糖复合物合成以及糖芯片技术中也有广泛的应用。 　　本研究利用叠氮标记的单糖类似物――Ac4GaINAz（图1）对人肝癌细胞系HCCLM6进行代谢性标记，单糖类似物进入细胞内参与正常糖代谢过程.可使细胞内的O-糖基化蛋白标记上叠氮基团，再通过叠氮和炔基的点击化学反应实现对蛋白的荧光标记，最后，利用二维电泳技术将蛋白进行分离以及MALDI―T0F质谱对蛋白进行鉴定（实验流程见图2）。本研究为寻找O一糖基化蛋白建立了良好的技术平台，为蛋白质O-糖基化的研究奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 细胞株 　　人肝癌细胞系HCCLM6南人类基因组南方研究中心张新教授惠赠。 　　1.1.2 相关试剂 　　胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）购白美国GIBCO公司；胰蛋白酶消化液（Try psin）和AlexaFluor 555荧光试剂（炔基荧光试剂，Alkynyl fluophor）购自美国Life technology公司；细胞裂解液成分为：1% NP-40，50 mmoUL Tris-HCL 150 mmoI/lNaCl， 0.1% SDS，Cocktail；细胞培养基DMFM/HICJH GLUCOSE、BCA定量试剂盒和蛋白 Marker购白美国Thermo公司；四乙酰化叠氮半乳糖胺（AC4GalNAz）由本实验室工胜老师合成；CuSO4、NaVc购自国药集团化学试剂有限公司；IP