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保存温度对黄颡鱼肝组织总RNA质量的影响 　　摘要：以黄颡鱼肝脏为试验材料，用TRIzol法提取肝脏组织总RNA，将试验样品置于不同温度下保存，在1%琼脂糖凝胶中电泳检测RNA的质量。结果显示：在低温没有密封储存的情况下，RNA保存较长时间，完整性好；-70 ℃下RNA可以保存8个月，-20 ℃下RNA可以保存4个月；在其他温度条件下，若密封保存，4 ℃下可保存2周，10 ℃下可保存4 d以上，20 ℃下保存3 d时条带清晰，保存4 d时条带模糊，30 ℃下保存2.5 d时条带变得模糊，到3 d时全部降解，40 ℃下保存1 d条带清晰，保存2 d条带变得模糊，保存2.5 d时完全降解。此外应注意的是，RNA如果暴露于空气中，5 h内所有试验组的RNA大多数降解。 　　关键词：黄颡鱼；肝脏总RNA；保存温度；RNA完整性 　　中图分类号：S917 文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）11-0258-03 　　近年来，分子生物学各项技术无论在医学方面还是生物学方面的各个领域均得到广泛应用，高质量的RNA则是其他后续试验的基础。如Northern bolt及杂交分析、寡聚（dT）纤维素选择分离mRNA、cDNA文库的构建、逆转录酶聚合酶链式反应（reversetranscriptase-polymerase chain reaction，简称RT-PCR）、RNA原位杂交、转基因材料鉴定、基因克隆及其表达等试验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量[1]，对于RNA的质量评价，完整性和均一性是其关键因素[2]。RNA特殊的单链结构导致其自身结构极不稳定，加上周围环境中广泛分布RNA酶（RNase）并且难以灭活，导致RNA很容易降解。有些试验过程中使用RNA的时间跨越度较大，因此确定RNA在不同温度下能保存的最长时间就尤其重要。关于不同温度对RNA质量的影响及不同保存温度下RNA能够保存的最长时间方面的研究，目前相关报道较少。本试验以黄颡鱼肝组织RNA为试验材料，研究不同保存温度对RNA质量的影响，以期为分子生物学研究者日后如何保存RNA提供可行性参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 试剂配制 　　0.5×TBE的配制。将10.8 g Tris、5.5 g硼酸、0.744 g EDTA-Na2溶解于经高温灭菌的2 000 mL蒸馏水中，充分摇匀，调节pH值至8.0。 　　琼脂糖凝胶的制备。取0.7 g琼脂糖溶解于盛有70 mL 0.5×TBE溶液的蓝盖瓶中，将其放入微波炉中反复加热3～4次，直至琼脂糖完全溶解；待胶液冷却至60 ℃，向其中加入7 μL GoldViewⅠ型核酸染色剂（其中琼脂糖的比例为1%，核酸染料的比例为0.01%），将胶液倒入事先已清洗干?簟⒘栏汕也迦胫平菏嶙拥慕翰壑?中，等到胶块冷却凝固后，即可将梳子拔出，完成用于电泳的琼脂糖胶块制作。 　　1.2 RNA的提取与检测 　　1.2.1 TRIzol法提取总RNA[3] 取健康黄颡鱼，用剪刀钝处猛击其头部使其昏厥，立即由泻殖孔剪至鳃盖后缘，迅速取肝脏组织（50 mg），将所取组织块放入1.5 mL EP管内并迅速置于液氮中速冻。 　　向提前灭菌的研钵中倒入液氮以预冷研钵、研钵棒，采用液氮冷冻组织的方法，将组织置于液氮中充分研磨5 min（在研磨过程中要注意及时补充液氮），最终将组织研磨至粉状。用经高温消毒的小钥匙将粉末集中，加入2 000 μL TRIzol试剂以充分破碎细胞组织（按每100 mg组织加入4 000 μL计算），待解冻后转入2个1.5 mL EP管内，离心5 min（13 000 g，4 ℃）。取900 μL上清液转至新的1.5 mL EP管中，加入400 μL三氯甲烷，用力振荡摇匀，室温静置5 min，离心15 min（13 000 g，4 ℃）。将上清液合并于新的1.5 mL EP管中，加入400 μL三氯甲烷，用力振荡摇匀，室温静置2～3 min，离心15 min（13 000 g，4 ℃）。取上清液于另1支EP管中，加入等体积异丙醇，轻轻摇匀，冰上静置15 min，离心15 min（13 000 g，4 ℃）。弃上清，向白色沉淀中加入用 1 000 μL DEPC水配制的75%乙醇清洗沉淀（轻摇混匀），离心5 min（13 000 g，4 ℃），倒掉上清液。真空干燥RNA沉淀，溶解于30 μL DEPC水中。整个总RNA提取过程均在冰上进行，实验台经70%乙醇消毒，铁制试验器具经200 ℃高温消毒300 min，塑料器具置于DEPC水中浸泡过夜后高温灭菌 40 min，试验步骤严格按照规范操作，以防RNA酶污染。 　　1.2.2 RNA质量检测 通过琼脂糖凝胶电泳的方法对各组RNA进行检