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包覆相脂解酶特性研究 　　摘要：文章系利用硅酸（由tetramethoxysilane水解产生）及polyallylamine进行仿生氧化硅包覆脂解酶（from Pseudomonas cepacia），并以包覆后脂解酶催化大豆油或废食用油与甲醇进行转酯化反应。以反应曲面法和Box-Behnken实验设计探讨反应温度、受质莫耳比（methanol/oil）、含水量（w/w of oil）对生质柴油含量的影响。 　　关键词：包覆；相脂解酶；硅酸；催化特性；脂肪酸 文献标识码：A 　　中图分类号：TQ645 文章编号：1009-2374（2015）31-0005-02 DOI：10.13535/j.cnki.11-4406/n.2015.31.003 　　1 脂解酶简介 　　1.1 脂解酶根据其催化特性分类 　　1.1.1 非特异性脂解酶（non-specific lipase）。此类脂解酶并不对三酸甘油酯的酯键有选择性，即脂解酶对三个酯键均可以进行反应（如水解、转酯化反应）。 　　1.1.2 1，3特异性脂解酶（1，3-specific lipase）。此类脂解酶只会对三酸甘油酯上之第1、3位之酯键进行反应，第2位之酯键则否。以水解三酸甘油酯为例：当1，3特定位脂解酶将三酸甘油酯水解成1，2或（2，3）-diglycerides，此时第2位酯键会自发性进行酰基转移（acyl migration）至第1或（3）位，进而再被1，3特异性脂解酶水解。 　　1.1.3 特定脂肪酸脂解酶（fatty acid specific lipase）。如Geotricbum candidium生产之脂解酶只对特定结构之脂肪酸有活性。此脂解酶只对三酸甘油酯中，第九个碳上有顺式双键的不饱和脂肪酸进行反应。对于饱和脂肪酸（无双键）、第九个碳上为单键则无反应。 　　1.2 生理及物理之特性 　　1.2.1 微生物脂解酶通常比植物或动物脂解酶更具稳定性。 　　1.2.2 嗜热微生物脂解酶在高温与不利的化学环境下较为稳定，极具工业应用之潜力。 　　1.2.3 由于酵素的专一性，不必要的副产物可以减少。 　　脂解酶是水解酵素的成员之一，作用于羧酸酯键。其生理角色是水解三酸甘油酯产生双酸甘油酯、单酸甘油酯、脂肪酸、甘油。除了可水解羧酸酯键，脂解酶亦可在非水相环境下催化酯化反应、内酯化反应、转酯化反应。因此，多元化的催化能力使得脂解酶可以应用于食品、清洁剂、制药、皮革、纺织、化妆品、造纸工业等（Hasan et al.，2006）。 　　2 Pseudomonas cepacia脂解酶介绍 　　在醇解反应中探讨不同微生物来源之脂解酶，其中Pseudomonas cepacia脂解酶催化醇解反应并加入油重1～20wt%之水分，反应90h后脂肪酸甲酯含量超过80%。当水含量低时，Candida rugosa及P.fluorescens脂解酶其反应速度显著下降，显示水可避免甲醇使这些酵素失活。另外，P.cepacia脂解酶于醇解反应中醇油莫耳比高达2∶1或3∶1时，仍能达到高甲基酯含量，故P.cepacia脂解酶较其他微生物来源之脂解酶对醇类耐受性较高。 　　以X-ray结晶法分析P.cepacia脂解酶在无抑制剂下之结晶结构，结构显示脂解酶含有α/β水解酶折迭以及三个具催化活性之残基Ser87、His286、Asp264。此酵素与同源之P.glumae脂解酶及Chromobacterium viscosum脂解酶在结构上有数个共通点，其中包含Ca2+结合位。此脂解酶呈现openconformation，其中包含溶剂可接触之活性位；相较于P.glumae脂解酶，其活性位隐藏于关上之“lid”之下。P.cepacia脂解酶之open conformation显示此酵素可在油水接口活化，活化时应伴随二级结构之调整使“lid”开启，将活化位暴露于外。 　　3 包覆相脂解酶活性分析 　　（1）包覆相脂解酶活性测量方法是将810μL的50mM Tris HCl buffer，pH8.0（含有0.4% TritonX-100及0.1%arabic gum）、90μL pNPL与100μL包覆相脂解酶溶液混合；（2）将此反应置于hybridization oven中反应温度37℃，50rpm，反应10min；（3）离心5min后抽取上清液，以去离子水稀释10倍后在A410下测量其吸收，再利用pNP标准曲线计算活性。 　　4 制备包覆相脂解酶 　　（1）取228μL tetramethoxysilane（TMOS）并加入1272μL 1mM HCl，于室温下反应15min使其水解，最终浓度为1M。由于水解后之TMOS长时间储存会凝结成胶，故每次