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利用基因芯片技术检测李痘病毒主要株系研究 　　摘 要：针对我国检疫性植物病毒即李痘病毒主要6个株系设计了6个特异性探针，同时设计了扩增该6个株系的一对通用引物，并确定了靶基因的PCR扩增体系和芯片杂交体系。对6个探针核酸序列进行同源性比对，结果表明探针之间的同源性只有39-61%，而各探针与本株系的同源性达到95%以上，因此适合作为检测李痘病毒主要株系的探针。成功设计的李痘病毒各主要株系的通用引物能够一次性扩增6个株系中的任何一个株系，而不需要做多重PCR，标记的扩增片段即可同芯片进行杂交，不但可以检测出李痘病毒，而且还能够明确是该病毒的哪个株系，检测结果直观明了，易于判定。芯片特异性好，能够正确区分6个株系，而且与其他植物病毒没有交叉反应。芯片的灵敏度高，可达到5pg/μL DNA模板浓度。 　　关键词：基因芯片；李痘病毒；主要株系；检测 　　李痘病毒（Plum pox virus， PPV）是我国2007年颁布的进境植物检疫性有害生物，是核果类果树危险性最大的病毒之一，属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）中的马铃薯Y病毒属（Potyvirus），其自然寄主主要是李属的木本植物，侵染李、杏、桃、樱桃等核果类果树后，使叶片和果实均受到严重危害，未成熟果实大量脱落，造成果实品质下降，产量降低。病毒远距离扩散则主要靠感染病毒的植物繁殖材料的调运。根据病毒的来源和侵染植物的不同，该病毒的目前主要株系有6个，它们分别为PPV-D， PPV-M，PPV-C， PPV-EA， PPV-W，PPV-Rec，其中D株系和M株系是目前最主要的流行株系。 　　由于植物病毒的特殊性，即一般种子和苗木带毒率是非常低的，加上进出境量通常非常之多，如果抽样量过少，则漏检的机率就一定非常之大，把关作用就会大大消弱；为了最大限度的提高检测率，避免漏检，就必须加大抽样量，这样就会导致样品众多，不仅会加大检测的工作量，而且会极大的影响检测速度，推迟通关速度，进而影响进出境贸易的正常进行，因此急需具有高通量检测的仪器设备和方法，而基因芯片技术正好适合这一要求。 　　基因芯片（gene chip）的最早是80年代中期由Dulbecco首次提出且目前已经在许多方面得到了广泛的应用[1，2，3，4]，其本质上仍然是核酸分子杂交方法，具体系指将大量（通常每平方厘米点阵密度高于400）探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足；而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、实变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。 　　目前基因芯片技术已经在许多方面得到了广泛的应用，但是在李痘病毒主要不同株系检测鉴定方面还未见诸报道，本项目预期达到的最终目标是研制出一次同时能够高通量检测李痘病毒主要株系的基因芯片和检测方法。 　　1 研究材料 　　1.1 李痘病毒毒株来源 　　1.1.1 D（Dideron）株系： Tey （X16415）、PENN2（AF401296）、Fan （AY912056）、Rankovic （M21847）、Skiernevice（S73776）。 　　1.1.2 M（Marcus）株系： SK68（M92280）、PS （AJ243957）、06 （S57405）、S57404（1768bp）。 　　1.1.3 EA（El Amar）株系：X56258，AM157175。 　　1.1.4 C（Cheery）株系：Y09851、AY184478、X97398。 　　1.1.5 W（Winona） 株系：AY912055。 　　1.1.6 Rec （Recombinants between D and M） 株系：AY028309。 　　以上株系均?自美国GADIA公司，其标准序列来自NCBI，括号中为其核酸序列登陆号。 　　1.2 芯片杂交材料 　　1.2.1 醛基载玻片：购自北京博奥晶典生物技术有限公司。 　　1.2.2 探针：本实验探针是人工合成的，长度41bp，并在合成的寡聚核苷酸探针末端（5端）带上氨基修饰，这种探针需要点制在醛基基片上。 　　1.2.3 点样液：购自北京博奥晶典生物技术有限公司；点样液的目的是使点出的点圆润均匀。 　　1.2.4 杂交液：购自北京博奥晶典生物技术有限公司。 　　1.2.5 洗液1：500ML： 量取440ml蒸馏水倒入1000ml试剂瓶中，加入50ml 20X