双分子荧光互补技术在蛋白质相互作用研究中应用.docVIP

双分子荧光互补技术在蛋白质相互作用研究中应用 　　【摘要】 双分子荧光互补技术（BiFC）是基于两个不发光的荧光蛋白互补片段在借助其融合蛋白的驱动下重新形成活性荧光蛋白，直接作为报告基因的可视化关键性技术，在探究各种模式生物体内蛋白质与蛋白质间相互作用（PPI）技术中日益受到重视。本文对BiFC技术原理、发展过程、应用现状、技术改进、及未来展望进行概述。 　　【关键词】 双分子荧光互补技术； 蛋白质相互作用； 荧光蛋白； 细胞信号转导 　　doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.12.042 　　细胞内蛋白质通常需要与其他蛋白质或配体结合，形成瞬时或稳定的复合体来实现其特定的功能，这种蛋白质与蛋白质之间的相互作用（protein-protein interaction，PPI）在人类、酵母、植物、线虫等各种生物体的生命活动中起着十分重要的作用[1-4]。目前，PPI研究技术发展迅速，常用的有免疫共沉淀、GST-pull down、表面等离子共振（SPR）、蛋白质芯片等体外实验技术，以及酵母双杂交、蛋白质片段互补（PCA）、荧光共振能量转移（FRET） 技术等。近十余年兴起的双分子荧光互补 （bimolecular fluorescence complementation，BiFC）技术由于无需试剂检测，能够通过荧光显微镜在接近活细胞生理状态的条件下快速、直观地检测目标蛋白是否具有相互作用，在PPI研究中的应用正日益广泛。 　　1 BiFC技术的原理 　　Regan（2000）和Kerppola（2002）两个研究小组最早发现和验证了活细胞内 BiFC 现象。他们首先将1个GFP的突变子增强型黄色荧光蛋白（EYFP）从不同位点切开，然后将一组相互作用、同向平行的亮氨酸拉链（bFos和bJun）分别融合到从Ala154-Asp155之间切开的增强型黄色荧光蛋白（EYFP）氨基（N）片段和羧基（C）片段，导入大肠杆菌中共表达。结果发现，所构建的一对融合多肽能够在细菌细胞中产生YFP的荧光，他们将这个现象称之为BiFC[5-6]。 　　除EYFP外，目前BiFC技术涉及的荧光蛋白已扩展到绿色荧光蛋白（GFP）、青色荧光蛋白（CFP）、红色荧光蛋白（RFP）及其突变体等多种荧光蛋白，其原理都是将荧光蛋白在特定的位点切开，形成不发荧光的N和C端 2个多肽，称为 N 片段（N-fragment）和C片段（C-fragment）。这2个片段在细胞内共表达或体外混合时，不能自发组装成完整的荧光蛋白。但是，当这2个荧光片段分别融合到一组有相互作用的目标蛋白上，在细胞内共表达或体外混合这两组融合蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，荧光蛋白的2个互补片段在空间上互相靠近，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，受到激发后发射出特定波长荧光（图1）。 　　图1 BiFC原理示意图 　　注：NGFP，GFP-N 端；CGFP，GFP-C端；A与B，能发生相互作用的一对蛋白 　　2 BiFC荧光蛋白的发展 　　早期用于BiFC 实验的荧光蛋白主要为绿色荧光蛋白（GFP）及其突变体，包括 EYFP、EGFP、EBFP 和ECFP[7-12]。由于它们必须在低温下（30 ℃）预孵化0～24 h以促进互补片段组装形成成熟的色团分子，因此，不利于生理条件下的胞内蛋白质相互作用的研究。2004-2008年，可应用于生理条件下的黄色荧光蛋白 Citrine和Venus以及青色荧光蛋白Cerulean荧光蛋白被相继引入BiFC技术[13]。2006年，Lin等[14]利用红色荧光蛋白 DsRed和eqFP578发展而来的mPlum，mKate，mKate2和Katushka荧光蛋白，构建了一组远红光荧光蛋白（far-red fluorescent proteins，FRFP）BiFC 系统。由于远红光能量低、穿透力强、不易引起细胞自发荧光和不易被细胞吸收，因此，能够克服在哺乳动物中无法实现荧光蛋白在组织成像的问题，在哺乳动物的组织成像中具有巨大的应用前景。2010年，梳状珊瑚中发现了类似于GFP的绿色荧光蛋白Dronpa[15]。Dronpa犹如一个光开关，在490 nm照射下发射出绿色荧光，而405 nm的波长照射则会使其猝灭。目前，以Dronpa为基础BiFC系统已用于揭示细胞核与细胞质间转录蛋白的作用机制、转录蛋白功能和蛋白质二聚化等的研究[16-18]。 　　3 BiFC技术在PPI研究中的应用 　　BiFC涉及的荧光蛋白不仅容易检测到BiFC信号，还可通过对可视化的荧光进行定量从而确定蛋白质相互作用的强弱。荧光蛋白片段一旦重建成完整荧光蛋白后大多数不可逆，因而特别适用于检测亚细胞环境中微弱的（mM级别） 和