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反胶团萃取分离纯化色氨酸研究 　　摘要:色氨酸是人体内的必需氨基酸之一。针对色氨酸的分离纯化,提出一种基于反胶团法的分离纯化方法。结果表明,采用AOT/异辛烷反胶团体系,在AOT浓度60mmol/L;;萃取pH为2.0;离子强度为0.1mol/L;反萃取PH为10;离子强度为1mol/L的条件下,经过一次萃取,回收率可以达到70%左右。 　　关键词:色氨酸 反胶团 AOT 萃取 　　 　　0 引言 　　 　　色氨酸是人体内的必需氨基酸之一。色氨酸对人和动物的生长发育、新陈代谢起重要的作用,对预防糙皮病、抑郁症,改善睡眠和增强自信心有着很重要的作用,广泛应用于医药、食品和饲料行业。反胶团是针对于生物活性的氨基酸或蛋白质提出的一种液液萃取体系。同传统氨基酸分离纯化手段相比,它具有分离步骤少、易于放大、高选择性、低成本的特点。从20世纪70年代末反胶团概念的提出到现在,它一直是生化工程研究领域的热点。在研究利用反胶团从实际复杂体系(如发酵液中)分离纯化目标蛋白时,如果直接从复杂体系入手,盲目性很强,很难对萃取过程或出现的问题进行准确的分析和判断。而从模拟体系入手,在研究清楚萃取过程的主要规律后,再进行复杂体系的研究,是一种事半功倍的研究思路。作者通过正交实验分析方法,研究了反胶团体系中AOT浓度、萃取PH、萃取离子强度、反萃PH和反萃离子强度五个因素对色氨酸萃取的影响,从而推断出最优方案。 　　 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1 实验材料 AOT(丁二酸-2-乙基己基磺酸钠)购自嘉善巨枫化工厂,异辛烷购自天津市福晨化学试剂厂,其他试剂购自上海苏懿化学试剂有限公司,均为分析纯。水溶液均用去离子水配制,实验在室温下进行。 　　1.2 萃取与反萃实验 将适量的AOT加入到异辛烷溶液中摇匀,使其均匀分布于有机相,得到澄清透明稳定的反胶团系统。准确量取1mL色氨酸储备液于不同缓冲液中,稀释,由不同浓度的离子构成酸缓冲液,PHPI)的离子强度的缓冲液作为反萃取水相,与前萃取所得的有机相混合,放在振荡机上剧烈摇晃后20min,倾入离心管,进行离心。用滴管小心地将两相分开,下层水相即为纯化的色氨酸。 　　1.3 色氨酸含量分析 利用对二甲氨基苯甲醛法测量水相中色氨酸含量。在752紫外光栅分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)上测定600nm处的吸光度,对照标准浓度-吸收度曲线,以计算色氨酸的浓度。色氨酸测量范围为0-100μg/mL。 　　 　　2 实验结果与讨论 　　 　　反胶团体系影响因素很多,需要对各个条件进行优化,选择色氨酸萃取最佳条件,但是各个因素太复杂,如果每个因素都分开讨论,工作量很大,而且需要很长时间,因此在实际实验中采用正交实验的方法。正交试验设计是利用“正交表”进行科学地安排与分析多因素试验的方法。其主要优点是能在很多试验方案中挑选出代表性强的少数几个试验方案,并且通过这少数试验方案的试验结果的分析,推断出最优方案,同时还可以作进一步的分析,得到比试验结果本身给出的还要多的有关各因素的信息。 　　 　　在本次实验中,对AOT浓度、萃取pH、萃取离子强度、反萃pH、反萃离子强度这五个因素进行考虑。 　　固定以下几个条件: 　　色氨酸储备液单位为1mg/ml;有机溶剂为异辛烷;表面活性剂为AOT;无助表面活性剂;萃取和反萃相比为1:1;萃取和反萃离子都为KCL;萃取时间15min;离心(3500r/min,5min);反萃时间为20min;离心(3500r/min,5min),萃取温度为室温。实验的各因素级水平如(表3-1): 　　取16个100mL的三角瓶,并依次编号,按照所述实验步骤进行操作,固定条件不变,但是对涉及正交的几个因素的种类和加入量按照表3-2进行试剂的正确加入,采用正交表进行实验,结果如下: 　　2.1 PH对萃取过程的影响 水相的PH值决定了色氨酸表面电荷的状态,从而对萃取过程造成影响,由于AOT为阴离子表面活性剂,在进行萃取过程中应该是PHPI,当pH值大于3.0时,萃取率较低,当PH=5.0时,萃取率几乎为零,因为此时水相PH接近色氨酸等电点,使色氨酸不能或者很少能进入反胶团;在PH3.0时,随着PH的降低,萃取率明显升高,是因为只有当反胶束内表面电荷,也就是表面活性剂极性基团所带的电荷与色氨酸表面电荷相反时,两者产生静电引力,萃取时势必要消耗较多的能量,这些能量只能通过较强的静电相互作用得到补偿,因此色氨酸才有可能进入反胶束,所以PH值2.0的萃取效果为最好。 　　在进行反萃取过程中PHPI,当PH值小于10时,萃取率较低;在PH10.0时,随着PH的升高,萃取率明显升高,以PH值11.0的萃取效果为最好,但是当PH12时,萃取效率降低。 　　2