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在南方红豆杉中接种美丽镰刀菌提高紫杉醇产量研究 　　摘要 以美丽镰刀菌和南方红豆杉为试验材料，通过在南方红豆杉植株中接种美丽镰刀菌，使两者发生相互作用，达到短期的共生平衡，二年生组和四年生组紫杉醇产量分别较接种前提高55.06%和22.08%，经t检验，试验组与对照组紫杉醇产量变化有显著差异。 　　关键词 美丽镰刀菌；南方红豆杉；紫杉醇；产量 　　中图分类号 S791.49 文献标识码A文章编号1007-5739（2008）20-0007-01 　　 　　内共生真菌和宿主植物的相互作用机理，是一个值得深入探究的课题。一般认为植物与内共生真菌呈互利共生的关系[1-3]，一方面内共生真菌可以从宿主植物中吸取营养，并得到保护；另一方面内共生真菌产生的代谢物能够促进宿主植物生长发育，增强宿主植物对生物胁迫（食草动物、昆虫、病原菌）及非生物胁迫（高温、干旱、高盐等）的抗逆性。 　　2002年，本实验室研究人员从中国南方红豆杉（Taxus mairei）中分离到1株产紫杉醇内生真菌，经鉴定属镰刀菌属，紫杉醇产量在液体培养时约20μg/L[4]，命名为美丽镰刀菌（Fusarium mairei）[5]。其后，采用原生质体诱变、发酵条件优化等方法，产量有了较大幅度提高[6]。 　　我们同时以美丽镰刀菌和东北红豆杉（T. cuspidate）悬浮细胞为试验材料，通过自己设计制造的耦合式生物反应器[7]进行耦合培养，以紫杉醇作为研究指标，初步研究了内共生真菌与宿主植物细胞的相互作用。经耦合培养，2种细胞的紫杉醇产量均有不同程度的提高，美丽镰刀菌增加了28倍，相应的东北红豆杉悬浮细胞增加了3.5倍[8]。 　　既然耦合培养能极大地提高2种细胞的紫杉醇产生能力，而这样的现象只能是2种细胞相互作用的结果，那么，从理论分析，在自然状态下F. mairei对红豆杉植株的影响应该接近于耦合培养所得到的结果。为此，我们设计了在红豆杉植株中接种内共生真菌，以期提高植株的紫杉醇产量。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1材料 　　美丽镰刀菌（Fusarium mairei），本试验室保藏；南方红豆杉（Taxus mairei）植株种植于本校药用植物园。 　　1.2仪器、试剂和培养基 　　1.2.1仪器。HPLC/MS（Platform ZMD 4000，WATERS corp.）；Masslynx V4.0 SP4（Micromass Ltd.）。 　　1.2.2试剂。paclitaxel标准品（97%，HPLC），购自Sigma公司；其余试剂均为分析纯。 　　1.2.3培养基。沙氏固体、液体培养基。 　　1.3方法 　　1.3.1T. mairei植株分组。T. mairei植株采用随机分组，以树龄分为2大组，每组10株，分别为二年生组（A组）和四年生组（B组），每大组分为2小组，每组5株，分别为对照组（Actrl、Bctrl）和试验组（AExp、BExp）。 　　1.3.2F. mairei接入T. mairei植株后植株紫杉醇含量变化的观察。弱化生长的F. mairei分别以等量接入各组T. mairei植株，每天在每株植株相对应的部位取样，测定紫杉醇含量。 　　1.3.3紫杉醇含量的测定。紫杉醇含量测定采用HPLC/MS法[9]。 　　1.3.4数据的检验。测定得到的数据用t检验进行分析判断。 　　 　　2结果 　　 　　2.1紫杉醇的含量变化 　　由表1、图1可知，试验A组紫杉醇含量较未接种前增加55.06%，而相应的对照A组仅增加9.38%，试验组与对照组间紫杉醇含量变化差异极显著（P＜0.01）。 　　试验B组紫杉醇含量较未接种前增加22.08%，而相应的对照B组增加-1.87%，试验组与对照组间紫杉醇含量变化差异极显著（P＜0.01）。 　　2.2试验B组紫杉醇含量的变化对于具体的试验株来说，其紫杉醇含量的变化是不均一的，目前尚无规律可循。由图2可知，以接种前为0d计100%，则株1、株4基本无变化，而最大的株5则增加了143.69%。 　　 　　3讨论 　　 　　对于T. mairei来说，F. mairei是外源的病源菌，一旦接入，必然导致机体的“免疫”反应。紫杉醇作为一种植物保卫素（phytoalexin）起着抵御外界生物侵入的作用，在感染病菌时必然出现大量合成，而对于真菌亦是如此。因此，在T. mairei中接入F. mairei后紫杉醇产量的提高是比较容易得到解释的。该情形与美丽镰刀菌和东北红豆杉耦合培养所得的结果相似[8]。而对于F. mairei来说，紫杉醇作为其正常代谢产物，自身具有一定的抗性，在这种情况下，两者将达到一种“妥协”，2种细胞将出现真正的“共生”局