嗜硫小红卵菌对常用除草剂草克星解毒作用.docVIP

嗜硫小红卵菌对常用除草剂草克星解毒作用 　　研究的动机 　　吡嘧磺隆是农药“草克星”的化学名称。查询资料后我们发现，吡嘧磺隆是人工合成的化合物，在自然环境中较难分解，对多种敏感作物产生毒害作用。用什么方法能够解决吡嘧磺隆的毒害问题呢？我们想到微生物是自然界中生长、进化速度最快的类群，在吡嘧磺隆高浓度环境下（如农药厂排污口处），是否会有个别微生物进化出解毒能力呢？如果能够筛选到这种解毒微生物，将会对解决吡嘧磺隆的残留药害有极大帮助，但这是否有实际可操作性呢？ 　　研究方法与过程 　　耐吡嘧磺隆胁迫微生物富集培养 　　采用富集培养法配制富集培养基，采用摇瓶富集培养：取1O.Og采集的土样，加入50mL富集培养液中，培养液吡嘧磺隆初始浓度设定为50mg/L，置于28℃、180r/min恒温摇床上培养7天之后，以2%的接种量接入新鲜培养液中，每隔l周转接1次，并以10mg/L为梯度逐渐提高吡嘧磺隆浓度至100mg/L，连续培养6轮，空白对照组同样连续培养6轮。 　　吡嘧磺隆解毒微生物检验 　　本实验参照钟亚兰等运用高效液相色谱表征高聚物的方法（钟亚兰等，2010）对吡嘧磺隆的量的变化进行测定，检验耐高浓度吡嘧磺隆胁迫微生物中可对其产生解毒微的生物是否存在。在富集培养最后一次转接前及经历7天培养后，各取培养物1.5mL，用高速离心机以12000r/min离心5min，上清液经0.22μm水相滤膜过滤，取滤液检测。 　　最后以吡嘧磺隆的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘出标准曲线，求出峰面积和浓度的相关方程。 　　解毒菌的分离与纯化 　　参照已有方法，采用10倍稀释法将富集液稀释，再用平板倾注法分离单菌，分别得到10-8～l0-1浓度的富集液；对每一梯度浓度稀释液各取100μL加入到2个灭菌的培养皿中，其中一个培养皿倒入0.5cm厚的牛肉膏蛋白胨培养基，另一培养皿倒入0.5cm厚的PSA培养基，在超净台的台面上水平混匀稀释液和培养基，冷却凝固后，置于28℃恒温培养箱中倒置培养，牛肉膏蛋白胨平板培养3天观察菌落，PSA平板培养5天观察菌落。将单菌落挑出，在相应平板上用四线法划线纯化菌株。 　　单菌解毒实验 　　在吡嘧磺隆浓度50mg/L的富集培养基中，分别接种纯化后的菌落，28℃、180r/min恒温摇床培养7天，同时以不接菌的培养基为空白对照；分别取培养前及培养7天的培养物1.5mL，12000r/min离心5min，取上清液过0.22μm的水相滤膜，取滤液检测。 　　吡嘧磺隆解毒菌的鉴定 　　Yc-5菌株的形态观察：以双层平板夹心层上生长的菌落形态描述菌落颜色、大小和形状。菌体的其他形态特征、培养特性及生理生化实验参照文献相应进行。 　　Yc-5菌株的rDNA-ITS分子鉴定：首先进行DNA扩增，将扩增的产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行胶回收，回收纯化后的产物送华大基因公司测序。将测得的ITS序列在GenBank中利用BLAST进行比对，选取一些与该序列最相似的其他菌株的序列，然后用软件MEGA4.0进行序列分析，再构建系统发育树，查看Yc-5与其他菌株亲缘关系的大小。 　　解毒菌解毒特性及实际应用研究 　　采用比浊法反映菌株生长并动态跟踪检测吡嘧磺隆浓度变化，绘制解毒菌生长解毒曲线。 　　若想要Yc-5解毒菌最大程度地发挥其吡嘧磺隆解毒能力，就要使其处于较优的解毒条件下，为此我们又对Yc-5解毒吡嘧磺隆的最佳条件进行了初步探索，还用油菜苗和饲养中的小虾做了解毒菌实际应用实验。 　　结果与讨论 　　耐吡嘧磺隆胁迫微生物富集培养 　　我们在湖南海特农药厂吡嘧磺隆生产车间采集了几袋污泥作为后续富集培养的样品来源（图1）。富集培养后，与未转接移种的空白对照组相比较，污泥实验组培养瓶中培养液明显浑浊致密，同时瓶体有少量细胞沉积（图l左）。这表明富集培养液中有大量微生物在生长、繁殖。 　　吡嘧磺隆解毒微生物检验 　　农药等有机物的浓度变化可通过色谱或质谱技术测定、显现。我们运用高效液相色谱测定吡嘧磺隆的量的变化，进一步证实富集培养基中是否存在能够分解吡嘧磺隆的微生物。结果表明不接菌的空白对照组浓度几乎未发生任何变化，而接种并经7天富集培养后的实验组，吡嘧磺隆浓度均显著下降。结果证实富集培养基中存在可解毒吡嘧磺隆的微生物群落。 　　解毒菌的分离与纯化 　　虽然富集培养瓶中证实有吡嘧磺隆解毒微生物的存在，但其中的微生物菌落混杂、成分不明，究竟是哪一种或哪几种微生物起到主要的解毒作用必须加以明确。参照已有方法，采用10倍稀释法将富集液稀释，再用平板倾注法分离单菌。本项目最终将其归类为7种不同的菌，并分别命名为Yc-1、Yc-2、Yc-3、Yc-4、Yc-5、Yc-6、Yc-7（图2）。通过初步形态观