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基于生物条形码信号放大电化学方法检测 　　摘要：通过抗原抗体的特异性识别作用以及生物条形码的信号放大作用，构建了一种新的电化学免疫传感器，用以检测人免疫球蛋白（hIgG）。将抗体Ab1修饰到金电极上，加入抗原（hIgG），经过抗原抗体的免疫反应再将已制备好的纳米金标记抗体Ab2和生物条形码（Ab2-AuNPs-B）修饰到该免疫传感器上，通过观察电化学阻抗的变化来监控免疫传感器的构建过程。利用生物条形码的信号放大作用，通过循环伏安法和差示脉冲伏安法对hIgG的含量进行定量检测，其检出限达到0.4×10-5 mg/L。 　　关键词：生物条形码；信号放大技术；生物传感器；hIgG；纳米金 　　中图分类号： Q511文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）02-0308-04 　　收稿日期：2015-02-26 　　基金项目：国家自然科学基金（编号21365016）。 　　作者简介：张瑶（1989―），女，硕士研究生，主要从事生化分析及生物传感器的研究。E-mail：zdjcyylx@163.com。 　　通信作者：晋晓勇，博士，副教授，主要从事生化分析及生物传感器的研究。Email：xiaoyongjin @126.com。蛋白质是生命的物质基础，它对人体的健康有着极其重要的作用[1-4]。人免疫球蛋白G（hIgG）是血清中含量最高的一种免疫蛋白，是机体再次免疫应答后形成抗体的主要组分，在机体防御机制中发挥着重要的作用，在临床上作为多种疾病诊断及疗效评价的重要指标[5-7]，因此对其进行定性、定量检测显得尤为重要。传统的免疫分析法检测hIgG由于存在操作步骤较为繁琐、仪器设备昂贵等缺点，因此在实际应用中受到了一定的限制，难以较大范围推广。 　　传统检测hIgG的方法主要有质谱法[8]、荧光分析法[9-10]、电化学分析法[11-13]等。其中，电化学方法由于具有较高的灵敏度、极低的检测限逐渐受到广泛关注。生物条形码因其较高的选择性和生物特异性也日益受到人们广泛重视[14-15]。早期的生物条形码主要用于DNA的检测[16-17]，而在蛋白质分子的检测及应用方面还鲜有报道。综合以上背景，本研究将电化学方法与生物条形码相结合，以hIgG为模型蛋白，对其进行定量定性分析。 　　1材料与方法 　　1.1仪器和材料 　　电化学工作站（EC550，湖北武汉高仕睿联科技有限公司），UV-265紫外仪（日本岛津），三电极体系：金盘电极（直径2.0 mm），饱和甘汞电极（SCE），Pt电极，KQ-2200B超声清洗器（江苏昆山超声仪器厂）。 　　本试验所用磷酸盐缓冲溶液（PBS）均为：Na2HPO4（天津市化学试剂六厂）和NaH2PO4（山东莱阳市双双化工有限公司）的混合溶液，Na2CO3（陕西西安化学试剂厂），氯金酸、叠氮化钠（阿拉丁试剂公司）等均为分析纯，试验用水均为超纯水。 　　兔抗人IgG抗体（Ab1）、hIgG、羊抗人IgG抗体（Ab2）购于北京博奥森生物技术有限公司。条形码序列B：5′-SH-TAGTAAGTAA-FC-3′ 合成于上海生工生物工程技术服务有限公司。 　　1.2纳米金（AuNPs）的制备 　　将100 mL 的氯金酸（0.01%）加入到250 mL的圆底烧瓶中加热，搅拌至沸腾后向其中加入4.0 mL的柠檬酸三钠（1%），继续加热10 min [18]，制成的纳米金于4 ℃下保存，用于制备金标抗体。 　　1.3AuNPs与Ab2及条形码序列（B）的结合（Ab2-AuNPs-B） 　　试验原理如图1-a所示，具体试验步骤如下：用Na2CO3调节纳米金pH值至9.0，加入100 μL Ab2（250 mg/L）振荡混匀，室温静置3 h，除去上清液中游离抗体，将离心后聚合物分散于0.05 mol/L含有0.05%叠氮化钠的PBS（pH值7.0）中。后将100 μL B（10 μmol/L）加入已制备好的Ab2-AuNPs中振荡均匀，室温静置1 h。离心，除去上清液中未结合的B。将已制备好的Ab2-AuNPs-B分离到0.05 mol/L含有 0.05% 叠氮化钠的PBS（pH值7.0）中，于4 ℃保存备用。 　　1.4电极修饰及免疫传感器的构建 　　将金电极（直径2.0 mm）用0.3 μm的Al2O3粉末打磨洗净，再用0.05 μm的Al2O3粉末将金电极打磨至光滑镜面。超纯水分2次超声清洗5 min，并将金电极浸入新制的Piranha溶液[98% H2SO4 ∶H2O2（体积比）=7 ∶3]约15 min。依次用超纯水、95%乙醇超声约3 min。将电极置于0.5 mol/L H2SO4 溶液中，在0～1.5 V电位范围内扫循环伏安曲线直至峰形稳定。最