多倍体诱导和60Coγ射线辐射对彩色马蹄莲Parfait分子水平遗传变异影响.docVIP

多倍体诱导和60Coγ射线辐射对彩色马蹄莲Parfait分子水平遗传变异影响 　　摘要：采用RAPD分子标记，对彩色马蹄莲Parfait（Pr）及其秋水仙素诱导的四倍体（Pr-d）和20、40、60 Gy 60Co γ射线辐射诱变后代（Pr-1、Pr-2和Pr-4）分子水平的变异进行研究。从40个寡聚核苷酸引物种筛选出14个合适的引物进行扩增，5个样品共扩增出位点90个，平均每个引物扩增出6.29个位点；其中，多态性位点39个，多态性位点的比率为43.33%。此外，还观察到的等位基因数（na）为1.4021个，有效等位基因数（ne）为1.2965个，Neis基因多样性（h）为0.166 6，Shannons多样性指数（I）为0.242 1。可见，多倍体诱导和辐射诱变使彩色马蹄莲Parfait在分子水平产生了一定的变异，丰富了彩色马蹄莲遗传多样性。通过聚类分析将5个样品可分为2支，其中Pr、Pr-2和Pr-d聚为一支，Pr-1和Pr-4聚为一支。 　　关键词：多倍体；诱导；彩色马蹄莲；RAPD；遗传相似性；聚类分析；抗病育种；分子生物学 　　中图分类号： S335.21；S682.2+64.03 文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2015）03-0142-02 　　彩色马蹄莲（Zantedeschia hybrida）为天南星科（Araceae）马蹄莲属（Zantedeschia）多年生草本植物，原产于南非[1]。自20世纪80年代末引入我国以来，彩色马蹄莲以其花色绚烂、花形高雅、观花期长而深受消费者的喜爱，因此被称为21世纪的“明星花卉”。彩色马蹄莲在栽培过程中最严重的病害是软腐病[2]，其在引种到我国长江中下游地区后受高温高湿的影响，软腐病病害问题更加突出，培育抗软腐病的彩色马蹄莲品种是解决这一问题的有效途径。但彩色马蹄莲所有品种对该病的抗性均比较弱；而且目前彩色马蹄莲新品种培育方式以杂交育种为主。很显然，这种育种方式很难培育出抗病的彩色马蹄莲品种。所以，研究人员探索采用物理或化学诱变的方式提高彩色马蹄莲的抗病性，从而培育抗病的彩色马蹄莲品种。本试验采用RAPD分子标记技术对彩色马蹄莲品种Parfait（编号为Pr）及其秋水仙素诱导的四倍体（编号为Pr-d）和20、40、60 Gy 60Co γ射线辐射诱变后代（分别编号为Pr-1、Pr-2和Pr-4）分子水平的变异和差异进行研究，为彩色马蹄莲抗病新品种的培育提供分子生物学依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　本试验材料为2002年引种自荷兰的彩色马蹄莲品种Parfait，其佛焰苞粉红色（上红下白），叶片盾剑形，上有斑点，引种后在本地的适应性良好。除Parfait外，还有经20、40、60 Gy 60Co γ射线辐射处理的Parfait组培苗及秋水仙素诱导的四倍体Parfait组培苗共5个样品，每个样品组培苗继代次数均在10次以上，随机选取10株，每株分别取样，然后混合，用于提取DNA。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 模板DNA的制备与检测 　　采用北京百泰克生物技术有限公司出品的新型快速植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）提取彩色马蹄莲叶片DNA；采用贝克曼库尔特公司生产的DU800紫外/可见光分光光度计测定DNA纯度和含量，并对浓度较高的样品进行稀释，-20 ℃储存，备用。 　　1.2.2 RAPD-PCR 体系及引物筛选 　　以提取的彩色马蹄莲Parfait DNA为模板，参照陆波等的方法[3]，对北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司和生工生物工程（上海）股份有限公司合成的40条引物进行多态性筛选，选择条带多态性强、扩增位点多的引物对供试的彩色马蹄莲品种及Parfait辐射诱变处理和多倍体进行RAPD扩增。 　　1.3 数据分析 　　每个样品的扩增条带按有（记为1）、无（记为0）进行记录，在Excel表格上生成数据矩阵。计算扩增条带的多态率，用POPGen32软件[4]进行聚类分析。 　　2 结果与分析 　　2.1 彩色马蹄莲样品RAPD分子标记结果 　　利用筛选出来的引物，对彩色马蹄莲 Parfait、Parfait四倍体和辐射诱变后代进行RAPD-PCR，最终筛选出具有特异性条带的引物14个，共获得90个位点，平均每个引物扩增出6.43个位点；其中，多态性位点39个，多态性位点比例为4333%。引物RAPD-47和RAPD-66扩增出的位点最多，均为9个；RAPD-73扩增出的位点最少，仅4个。引物RAPD-66扩增出的多态位点比例最高，为88.89%；有半数引物扩增出的位点全部为共有位点，多态性位点比例为0（表1）。由引物66扩增的RAPD图谱（图1）可见，多倍体诱导和 60Co γ射线辐射