天山雪莲悬浮培养细胞中紫丁香苷绿原酸和1,5―二咖啡酰奎尼酸生物合成调控.docVIP

天山雪莲悬浮培养细胞中紫丁香苷绿原酸和1,5―二咖啡酰奎尼酸生物合成调控 　　[摘要]紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸为野生天山雪莲中的3种活性化学成分，具多种药理活性，在药材中含量较低。研究在筛选得到天山雪莲上述3种化学成分高产细胞系的基础上，通过外源添加碳源和生物合成前体的方法调控紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸在天山雪莲培养细胞中的生物合成，极大地提高了其含量和产量。仅需培养16 d，紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的质量浓度即可以分别达到339.0，225.3，512.7 mg?L-1；三者的含量分别为野生药材的67.9，1.9，10.6倍。研究为最终实现通过天山雪莲细胞培养同时规模化生产以上3种活性成分打下了坚实基础，具有理论和实际应用意义。 　　[关键词]天山雪莲；紫丁香苷；绿原酸；1，5-二咖啡酰奎尼酸；细胞悬浮培养；生物合成调控 　　天山雪莲Saussurea involucrata，又名新疆雪莲，大苞雪莲，为菊科凤毛菊属Saussurea多年生草本植物，被历代医书奉为雪莲类药材的正品，用于治疗风湿性关节炎、肺寒咳嗽、闭经、胎衣不下、阳痿等疾患[1]，是一种极有开发和利用价值的传统药材。由于长期以来对雪莲的掠夺性采挖，加上自然环境中繁殖困难，生长缓慢，野生天山雪莲已处于濒危的境地，属国家二级濒危保护植物，野生天山雪莲资源已难以满足临床药用开发的需求。植物组织细胞培养等生物技术手段的发展可为天山雪莲中活性次级代谢产物的生产提供切实可行且可持续利用的途径，如已报道的有通过天山雪莲细胞培养生产黄酮[2-3]，通过发状根培养生产紫丁香苷[4]，通过组培苗生产紫丁香苷和芦丁[5]。 　　紫丁香苷（syringin）、绿原酸（chlorogenic acid）和1，5-二咖啡酰奎尼酸（1，5-dicaffeoylquinic acid）为野生天山雪莲中的3种活性化学成分，但含量较低，本研究组前期筛选得到1株可以同时高产该3种成分的天山雪莲细胞系，并对其化学成分进行了系统的分离分析[6-8]。据报道，紫丁香苷具有抗炎镇痛[9]、抗高血糖[10]、抗抑郁[11]及抗癌[12]活性，在《中国药典》中被规定为天山雪莲、刺五加等药材以及相关制剂的定性和定量指标。绿原酸具有抗炎[13]、抗高血糖[14]和抗乙型肝炎病毒作用[15]，被认为是众多药材和中成药抗菌解毒、消炎利胆的主要有效成分。1，5-二咖啡酰奎尼酸具有很好的抗氧化[16] 、治疗糖尿病[17]和抗艾滋病[18-19]作用。综上所述，紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸具有多种药用活性，具有重要应用价值。目前该3种物质的主要来源仍为从野生植物中提取，然而，除绿原酸在菊科、忍冬科植物中分布较广、含量较高外，其他2种物质在植物中分布少、含量低，且往往与多种同系物及其他类型次级代谢产物一同混合存在，分离纯化较为困难。本研究在筛选得到天山雪莲高产细胞系的基础上，通过外源添加碳源和生物合成前体的策略调控紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸在天山雪莲培养细胞内的生物合成，极大地提高了以上3种成分的含量和产量，为最终实现通过天山雪莲细胞培养同时规模化生产以上3种活性成分打下坚实基础，具有理论意义和实际应用前景。 　　1 材料与方法 　　1.1 仪器与试剂 培英HYG-A全温摇瓶柜（太仓市实验设备厂）；YT-CJ-2ND型洁净工作台（北京亚泰科隆仪器技术有限公司）；Agilent 1200分析型高效液相系统及Agilent LC系统化学工作站（Agilent，Germany）；超声提取用10200A型超声波清洗器（AUTO SCIENCE，Canada）。 　　紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸对照品为本研究组从天山雪莲培养细胞中分离得到，并经1H-NMR，13C-NMR，MS进行了结构确证[7-8]，面积归一化法显示以上对照品纯度均为98%以上。色谱级乙腈和甲醇（Merck，Germany）；色谱级磷酸（Mreda，USA）；L-苯丙氨酸（Amresco，USA）；NAA，6-BA，2，4-D（Sigma-Aldrich，USA）。细胞培养实验中所用其他试剂均为分析纯。 　　1.2 材料来源 天山雪莲培养细胞诱导自采自新疆天山地区的野生天山雪莲成熟种子萌发得到的无菌苗的叶片，结合次生代谢成分分析反复筛选1年以上得到稳定高产紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的天山雪莲细胞系。 　　1.3 细胞悬浮培养 细胞悬浮培养物于黑暗（25±2） ℃摇瓶旋转振荡培养。采用附加植物生长调节剂α-NAA（α-萘乙酸）0.5 mg ?L-1，6-BA（6-苄基嘌呤）0.5 mg ?L-1和2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）0.2 mg ?L-1