第十五节 分子杂交技术讲稿.doc

PAGE PAGE 7 第十五章 分子杂交技术 第一节 核酸杂交的基本原理 1、核酸分子杂交定义： 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把 DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链（heteroduplex）（参照图讲解）。 2、探针技术 2.1 探针 (probe) 定义： 一段常用同位素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在（参照图讲解）。 2.2 探针形式（举例说明） 3、核酸的变性 在物理或化学因素的影响下，维系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA双螺旋解旋成为单链的过程称为核酸的变性（denaturation）。 变性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加。 加热变性是实验室最常用的方法 一般当温度在70℃以内时，DNA 温度在70～90℃之间时，DNA 温度大于90 ℃时，DNA变性使双链打开，温度大于100℃时，DNA 增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。 在热变性过程中，通常将增色效应达一半时即双螺旋被解开一半时的温度称为变性温度或融解温度（melting temperature），用Tm表示。 影响 Tm值的因素 ： （1）碱基的组成： GC含量愈高的DNA不易变化，其Tm值愈高。 在标准条件下即0.15mol/L Nacl 0.15mol/L柠檬酸钠溶液中（1×ssc）， Tm值与碱基对组成之间的经验公式是：Tm =69.3+0.14（G+C）% Tm值还与DNA分子的长度有关，DNA分子越长，Tm值越大。 （2）溶液的离子强度： 在高离子强度溶液中，Tm值较高，解链温度范围较窄。 同一种DNA分子在不同离子强度溶液中其Tm值不同。 在高离子强度溶液中，Tm值较高，解链温度范围较窄。 （3）pH值： 核酸溶液的pH值在5～9范围内，Tm值变化不明显。当核酸溶液的pH低于3或高于10时，核酸的双链可以完全打开成为单链核酸分子。 （4）变性剂： 当核酸溶液中含有一定浓度的化学试剂如尿素、甲酰胺、二甲基亚砜等，可降低Tm值。 （5）其它： RNA变性转变不如DNA明显. 二、核酸的复性 变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性（renaturation）。 影响DNA复性速度的因素： 主要为DNA样品的性质，如简单序列的DNA要比顺序复杂的DNA复性快；DNA浓度高，使分子之间碰撞机会增加，复性快；长的DNA分子运动慢，复性速度低，复性最快的DNA片段为基因组中的高度重复序列。 复性可分为两个阶段：首先是成核，其次是拉链式。 复性反应速度 1. 用Cot值来衡量，它是DNA分子的起始浓度Co (以 mol/L 表示) 与复性时间（t）的乘积，单位是mol . Sec . L-1。 2. 任何DNA的复性都可用Cot 1/2表示，Cot 1/2越大，复性反应越慢。 3．核酸的杂交及影响杂交的因素 3.1 温度与时间 杂交反应温度一般低于Tm 10～15℃。 核苷酸杂交的有效反应时间从理论上讲，在3h左右。 但为稳妥起见，一般将杂交反应时间定为16～20h，或为简便起见杂交孵育过夜。（具体实验具体对待）。 3.2 离子强度 在低离子强度下，核酸杂交非常缓慢，随着离子强度的增加，杂交反应率增加。在进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐酸浓度和洗膜溶液的盐浓度。 3.3 探针的浓度和长度： 探针长度控制在50～300bp为好。 双链探针的浓度一般为0.1-0.5 μg/ml。 杂交时如果使用单链核酸探针，随着溶液中探针浓度的增加，杂交效率也增加。 3.4 非特异性杂交反应 为减少非特异性杂交反应，在杂交前将非特异性杂交位点进行封闭，以减少其对探针的非特异性吸附作用。常用的封闭物：鲑鱼精子DNA（salmon sperm DNA）或小牛胸腺（calf thymus DNA)、Denhardt溶液，也可用脱脂奶粉。 第二节 核酸分子杂交技术 1、固相分子杂交定义： 固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸链游离在溶液中，固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。 滤膜杂交的基本过程： 该方法分为菌落印迹原位杂交、斑点印迹杂交、southern印迹杂交和Northern印迹杂交四类。