TNF-α对巨噬细胞源泡沫细胞ABCA1表达的影响-细胞生物学专业论文.docxVIP

山东师范大学硕士学位论文 山东师范大学硕士学位论文 山东师范大学硕士学位论文 山东师范大学硕士学位论文 ii ii 3 实验结果 23 4 结果讨论 23 第三章 胞内脂质含量油红 O 染色检测 25 1 实验材料 25 1.1 主要材料 25 1.2 主要仪器及试剂 26 1.3 主要试剂配制 26 2 实验方法 26 3 实验结果 27 4 结果讨论 27 第 四 章 影响 A BCA 1 表 达 的 相 关 基 因 荧 光 免 疫 组 化 检 测 29 1 实验材料 31 1.1 主要材料 31 1.2 主要仪器及试剂 31 1.3 主要试剂配制 31 2 实验方法 32 2.1 免疫组化试验方法 32 3 实验结果 33 3.1 TNF-α 对小鼠腹腔巨噬细胞源泡沫细胞 ABCA1 表达的影响 33 3.2 TNF-α 对小鼠腹腔巨噬细胞源泡沫细胞 NF-κB 表达的影响 38 3.3 TNF-α 对小鼠腹腔巨噬细胞源泡沫细胞 PPARγ 表达的影响 42 4 结果讨论 47 总 结 50 攻读硕士学位期间发表的学术论文 58 致 谢 59 TNF-α 对巨噬细胞源泡沫细胞 ABCA1 表达的影响 摘 要 动脉粥样硬化（Artherosclerosis, AS）作为一种慢性炎症性疾病，已经成为世界范围内 死亡率最高的疾病之一。巨噬细胞能启动脂质条纹形成，在动脉粥样硬化病理过程中具有 重要作用。脂质条纹主要由巨噬细胞源泡沫细胞构成，而巨噬细胞泡沫化则是由胞内脂质 代谢及转运紊乱导致。巨噬细胞胆固醇稳态的调控涉及多种因子，包括清道夫受体、参与 胆固醇代谢的酶类以及胆固醇转运蛋白，如 ATP 结合盒转运蛋白（ABCA1、ABCG1 和 ABCG4 等）和清道夫受体 B1（scavenger receptor B1, SR-B1）。巨噬细胞质膜上的清道夫 受体包括清道夫受体 A（scavenger receptor A, SR-A）和 CD36，他们可以介导修饰脂质特 别是氧化 LDL（ox-LDL）的摄取。ox-LDL 在溶酶体中降解为游离胆固醇或被修饰成无活 性的胆固醇酯。ABCA1 能够将胞内过剩的游离胆固醇传递给 apoA-I 或 apoE，从而促进胆 固醇外流，抑制巨噬细胞泡沫化。增加 ABCA1 的表达具有抗 AS 作用。近几年研究显示， 过氧化物酶体增殖激活受体 γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ）和核因 子-κB（nuclear factor-κB, NF-κB）在调控巨噬细胞炎症和胆固醇稳态方面发挥着重要作用。 作为一种重要的炎症因子，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α）很可能具有调 控泡沫细胞 ABCA1 表达的功能。 本实验主要研究促炎因子 TNF-α 对 ABCA1 表达的调控作用，并且阐述 PPARγ 与 NF-κB 之间是否存在相互作用、参与 TNF-α 对 ABCA1 表达的调控。分离并纯化 TNF-α-/- 型和野生型（WT 型）C57BL/6J 小鼠腹腔巨噬细胞，与 50μg/ml ox-LDL 孵育 48h 以诱导 巨噬细胞泡沫化。实验分为两组对照组，一组泡沫细胞仅添加外源 TNF-α（10ng/ml）处理 24h，另一组使用 ox-LDL（50μg/ml）和 TNF-α（10ng/ml）共同处理 24h。应用荧光免疫 组织化学方法研究 TNF-α 对巨噬细胞源泡沫细胞内 ABCA1 表达的影响，以及该过程可能 涉及的信号通路间的相互作用。 实验结果显示：未泡沫化前，TNF-α-/-型小鼠腹腔巨噬细胞内 ABCA1 表达量极少，与 WT 型无明显差别。加入 ox-LDL 诱导泡沫化后， ABCA1 表达量明显增加，但两种基因 型之间无明显差别。在泡沫细胞中加入外源 TNF-α 后，ABCA1 表达量明显下降，因而推 测 TNF-α 对 ABCA1 表达的抑制作用与 TNF-α 浓度相关。巨噬细胞 NF-κB 的表达量在泡 沫化后无显著增加，向泡沫细胞中添加 TNF-α 可激活 NF-κB 核易位，ox-LDL 对 NF-κB 核 I 山东师范大学硕士学位论文 山东师范大学硕士学位论文 山东师范大学硕士学位论文 山东师范大学硕士学位论文 PAGE PAGE IV 易位也有一定刺激作用。ox-LDL 可刺激 PPARγ 的表达和核易位，并且这种作用与时间呈 正相关；TNF-α 对泡沫细胞 PPARγ 的激活有一定抑制作用，但并不显著。 TNF-α 可通过激活 NF-κB 通路显著降低泡沫细胞中 ABCA1 表达水平，但 PPARγ 并不 能逆转 NF