Tim3参与巨噬细胞炎症反应的机制及对巨噬细胞抗原呈递作用的研究-免疫学专业论文.docxVIP

摘 要 背景：T 细胞免疫球蛋白及粘蛋白家族-3（Tim3）作为 Tim 家族的成员，有 281 个 氨基酸组成，最先被发现特异的表达在 CD4+ Th1 细胞上，而不在 Th2 细胞上表达。这 个发现促使人们去研究 Tim3 是如何调节 Th1 型细胞反应，又是如何在自身免疫性疾病 中发挥作用？ Tim-3 分子通过负性调节 Th1 细胞的功能广泛参与了特异性免疫应答的 调节。近期研究发现，Tim-3 在 DC、单核细胞、巨噬细胞等天然免疫细胞表面也有表 达，通过激活炎症细胞发挥促炎症作用。 目的：探讨 Tim-3 对巨噬细胞功能的调节作用及其机制。 方法：（1）首先将含 Tim-3SiRNA 及 NC 对照序列的载体经脂质体分别转染细胞系 RAW264.7，以 G418 加压筛选，通过 RNA 干扰降低 Tim3 在巨噬细胞表面的表达，构 建了一种稳定低表达 Tim3 的 RAW264.7 巨噬细胞系。以野生型及低表达 Tim3 的巨噬细 胞为研究对象，探讨 Tim-3 对巨噬细胞活性及表型的影响。（2）体外阻断或激活 Tim3 通路，ELISA 法检测巨噬细胞等天然免疫细胞分泌炎症因子 TNF-α、IL-6 的水平；通过 Western blot 方法检测炎症反应信号通路中关键分子 AKT 、PAKT、NF-kB 的变化；通 过 ELISA 法、Western blot 检测 Tim-3 与模式识别受体 TLR4 的相互作用。双荧光素酶 报告基因系统检测 NF-kB 的活性。通过以上方法检测 Tim3 参与巨噬细胞炎症反应的机 制。(3) 建立败血症动物模型，观察 Tim3 在败血症早期和晚期的不同作用。 (4) 以败 血症小鼠模型为基础，Tim-3 体内阻断实验检测 Th1、Th17 细胞活性，研究 Tim-3 对 Th1,Th17 的分化的影响以及对小鼠腹腔巨噬细胞表面共刺激分子 CD80、CD86 的表达 的影响。同时体外实验检测 Tim3 对巨噬细胞表面共刺激分子 CD86/CD80 表达比例的影 响以及对 Th1,Th17 的分化的影响。从体内实验和体外实验两方面探讨 Tim3 对巨噬细胞 抗原呈递作用及对 Th1,Th17 细胞极化的影响。 结果：（1）成功构建了重组载体 Tim3-siRNA，建立了稳定低表达 Tim3 的巨噬细胞 系。(2)为了探讨 Tim-3 在天然免疫中的调节作用，我们观察了 Tim-3 对巨噬细胞活性的 影响，结果显示 Tim-3 刺激巨噬细胞分泌炎症因子 TNF-α、IL-6。同时 ELISA 结果显示 Tim3 通路和 TLR4 通路在刺激巨噬细胞释放炎性因子 TNF-α 方面存在相互拮抗效应。 Western blot 结果也显示 Tim3 信号通路和 TLR4 信号通路的相互拮抗关系涉及到对一些 重要的信号分子的影响，如 AKT 活性过强抑制了 NF-kB 活性，从而抑制了 LPS 介导的 I PAGE PAGE IV TNF-α的分泌。（3）体内实验结果显示，以败血症小鼠模型为基础，Tim-3 在败血症早 期表达升高，发挥抗炎作用，而在败血症后期表达失调。（4）体内体外实验结果显示， Tim-3 在提高 CD86，降低 CD80，提高 CD86/CD80 的比例中发挥重要作用。同时 Tim-3 可以促进 Th1 及 Th17 细胞的分化，表现为 Th1 型细胞因子 IFN-γ，以及 Th17 型细胞因 子 IL-17 表达的升高。 小结：（1）Tim3 通过促使巨噬细胞分泌炎症因子 TNF-α、IL-6 参与了天然免疫反应调 节。（2）Tim3 通路和 TLR4 信号通路在介导炎症反应方面存在相互拮抗效应。（3）Tim3 参与了巨噬细胞表面 CD80，CD86 共刺激分子的调节，Tim-3 通过提高 CD86/CD80 的 比例促进 Th1 及 Th17 细胞的分化。（4）本实验为认识 Tim-3 在天然免疫和获得性免疫 中的作用提供了新的机制，为 Tim3 在巨噬细胞介导的免疫反应中的调节作用提供了新 的理论依据。 关键词：Tim3，巨噬细胞，天然免疫，获得性免疫 ABSTRACT Backgrounds: Tim3, a member of the Tim (T cell immunoglobulin and mucin domain) family , is the first identified to be specifically expressed on CD4+ Th1 but not on Th2 cells. The Tim3 gene encodes a 281-amino acid protein that is expressed