油梨果肉DNA提取方法比较.docVIP

油梨果肉DNA提取方法比较 　　摘 要 为了获取高质量的油梨果肉DNA，以油梨果肉为试材，比较改良SDS法、改良CTAB法和试剂盒法对油梨果肉DNA的提取效果。结果表明：上述3种方法均可从油梨果肉中提取DNA，但改良SDS法与改良CTAB法所获得的DNA浓度都在600 μg/mL以上，纯度（OD260nm/OD280nm）均在1.8左右，纯度高且完整性较好，可用于未来分子标记分析。 　　关键词 油梨 ；果肉 ；DNA提取 ；改良SDS法 ；改良CTAB法 　　中图分类号 S667.9 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.12.007 　　油梨（Persea americana Mill.）为樟科油梨属植物，又名鳄梨、牛油果，英文名为avocado。油梨起源于中美洲、墨西哥热带湿润地区及海拔较高的山地森林或热带高原，是著名的热带、亚热带果树，也是一种木本油料作物[1]。油梨于1918年被引种到中国台湾省，在海南、广东、广西、贵州、云南、台湾等地均有栽培[2-5]。油梨果实形状一般为卵圆形、倒卵圆形、圆形及梨形，重量通常为50～2 000 g[6]。油梨果肉是由果皮发育而成，富含脂肪酸、膳食纤维、蛋白质、多酚、黄酮、叶酸等多种营养物质及活性成分，其中油梨脂肪酸含量根据品种及种植条件的差异可达到其果实重量的15%～30%[7-8]。但对于DNA提取，多酚、黄酮、脂肪酸等物质会使DNA氧化成褐色凝胶状物或与DNA结合成黏稠胶状物，阻碍其作为PCR模板进行分析[9-11]。这就需要对传统的DNA提取方法加以改进，以提取出高质量的DNA。周海兰等[12]以油梨叶片为试材，对比了传统CTAB法、改良CTAB法和试剂盒法3种方法的提取效果。结果显示，通过改良CTAB法所提取的DNA的浓度和纯度要远高于通过传统CTAB法所提取的DNA。但周海兰等[12]仅对传统的CTAB法进行了改良，而未对另一种广泛应用的SDS法进行改良并分析其效果。此外，油梨果肉中所含有的影响DNA提取的物质含量，如脂肪酸、多酚、黄酮等含量，要远高于油梨叶片[6]。所以提取油梨果肉的难度要远高于油梨叶片。提取到高质量的DNA或RNA是许多分子生物学实验（PCR扩增、基因克隆、基因表达等）的初始第一步骤，而油梨作为热带水果，果肉是油梨研究的主要部位，对油梨果肉组织进行分子生物学实验将有助于深入研究油梨果肉中营养物质及活性成分的生成、代谢等[1，13]。前人已经发表了有关油梨果肉RNA提取的优化方案，但对于相对较容易的油梨果肉DNA提取优化方案未见相关报道[13]。本实验通过比较改良SDS法、改良CTAB法和试剂盒法对油梨果肉DNA的提取效果，以期获得高效的油梨果肉DNA提取方法，为后续的分子生物学实验提供参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　本试验所用优良油梨品系‘RN-5’果实样品于2016年8月在海南省儋州市中国热带农业科学院果树基地采集。每个DNA提取方法重复3次。 　　1.2 方法 　　1.2.1 改良SDS法和改良CTAB法 　　本实验采用的改良SDS法和改良CTAB法参照朱威龙等[14]的SDS法和CTAB法，改良之处如下：（1）在样品研磨步骤中加入0.03 g聚乙烯吡咯烷酮；（2）在SDS提取缓冲液或CTAB提取缓冲液中加入2%（m/V）的聚乙烯吡咯烷酮；（3）在温水水浴前，加入20 μL β-巯基乙醇，并于SDS提取缓冲液或CTAB提取缓冲液混匀；（4）水浴冷却后加入的提取液中加入酚，并且酚与氯仿和异戊醇的体积比为25∶24∶1；（5）延长异丙醇沉淀时间到过夜。 　　1.2.2 试剂盒法 　　称取幼嫩叶片0.2 g，加入液氮充分研磨，使用天根生化科技（北京）有限公司生产的DNA secure plant Kit（DP320）新型植物基因?MDNA提取试剂盒（离心柱型）进行提取，具体操作见产品说明书。 　　1.2.3 DNA质量检测 　　取DNA样品20 μL，用TE缓冲液稀释至10倍，用紫外分光光度计测定其OD260nm和OD280nm。DNA浓度=OD260nm×10（稀释倍数）×50（μg/mL）；DNA纯度=OD260nm/OD280nm。 　　取DNA样品10 μL，加入5 μL溴酚蓝缓冲液，用5%琼脂糖凝胶电泳，15 min后拍照，分析DNA的质量和完整性。 　　1.2.4 EST-SSR分子标记验证提取效果 　　以3种提取方法所获得的DNA为模板，采用油梨EST-SSR引物SHRSPa003进行PCR扩增，以检测3种DNA 提取方法的效果。油梨EST-SSR引物SHRSPa003序列信息来自Borrone等[15]的文献，油梨EST-SSR引物PCR扩