洛伐他丁和膦胺霉素对烟草HMGR和DXR活性影响.docVIP

洛伐他丁和膦胺霉素对烟草HMGR和DXR活性影响 　　摘要：HMGR和DXR分别是萜类生物合成途径――MVA和MEP途径的2个关键酶。本研究对烟草施用HMGR和DXR的专一抑制剂洛伐他汀（MEV）和膦胺霉素（FSM），测定烟草NtHMGR、NtDXR、FPPS和GGPPS基因转录水平、HMGR和DXR酶活性变化。结果表明，抑制剂处理后烟草内源基因NtHMGR和NtDXR表达量在24h受到明显抑制；HMGR和DXR活性均在一定时间内受到抑制。MEV和FSM能有效抑制烟草中HMGR和DXR的活性。 　　关键词：3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）；1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR）；洛伐他汀；膦胺霉素 　　中图分类号：TS411文献标识码：A 　　植物萜类化合物的生物合成至少有2条途径。细胞质中的甲羟戊酸途径（mevalonate pathway，MVA途径）；质体中的2-甲基赤藓糖醇-4-磷酸途径（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway，MEP途径）[1]。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMGR）和1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR）分别是MVA和MEP上游途径中的2个关键酶[2，3]。 　　洛伐他丁（mevinolin，MEV）是HMGR的专一抑制剂，它能与HMGR的活性部位结合，竞争性抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）转变成甲羟戊酸（MVA）[4，5]；膦胺霉素（fosmidomycin，FSM）是DXR的专一抑制剂，它能阻断1-去氧木糖-5磷酸（DXP）合成2-甲基赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）[6，7]。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　野生型烟草“中烟90”种子，由广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心保存。 　　1.2主要仪器与试剂 　　MEV（美国Sigma公司）；FSM（美国Sigma公司）； CFX96荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）；UV-1800型紫外分光光度计（日本岛津公司）。 　　1.3方法 　　1.3.1考察抑制剂喷施浓度和取样时间 　　考察喷施浓度和取样时间：播种烟草种子，温室培养至三叶一心期（苗龄约6周），进行喷施。植株分为4组，分别喷施MEV、MEV溶剂对照、FSM、纯水对照，连喷3d，观察植株生长情况，取致植株全部白化或变形的最低浓度为抑制剂最适浓度。未处理烟草长至6个月，喷施最适浓度抑制剂，喷施前采样作为0h样品，喷施处理6h、12h、24h、36h、48h后各采集叶片100mg，提取RNA，荧光定量PCR检测。引物见表1，引物退火温度筛选、标准曲线建立方法参考文献[8]。反应条件为：95℃ 30s；95℃ 3s，60℃ 5s，40个循环。采用比较Ct值法[9]计算基因相对表达量F，公式为F=2-△△Ct，其中△△Ct=（待测组目的基因Ct值-待测组内参基因Ct值）-（对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值）。0h样品检测NtHMGR、NtDXR基因表达量，MEV及对照喷施组检测NtHMGR基因的表达量，FSM及对照喷施组检测NtDXR基因表达量。 　　1.3.2基因表达量和酶活性的测定 　　用考察浓度后的抑制剂喷施苗龄6个月的烟草，测定烟草内源基因NtHMGR和NtDXR、下游基因FPPS和GGPPS表达量。喷施前采样作为0h样品，喷施处理24h、36h、48h后各采集烟草叶片100mg。酶活性的测定根据底物专一性原理，具体测定方法参考文献[10]。烟草叶片于MEV喷施处理后12h、24h、48h后采集，FSM喷施处理后24h、48h后采集。 　　2实验结果 　　2.1确定MEV和FSM喷施烟草最适浓度和取样时间 　　MEV喷施烟草后，叶片呈现皱缩的现象，如图1，使用不同浓度MEV喷施后，烟草皱缩苗率有所不同，用350μmol/L喷施后，烟草皱缩苗率达到57.5%，而400μmol/L喷施后皱缩苗率仅为45%，溶剂喷施后叶片没有出现皱缩（图2）。故采用350μmol/L的MEV为最适喷施浓度。 　　a.喷施MEV后的皱缩苗b.喷施溶剂后的正常苗图1350μmol/L MEV和溶剂喷施后烟草幼苗表型对比 　　图2不同浓度MEV喷施烟草幼苗后的皱缩苗率 　　FSM喷施烟草后，叶片呈现黄化及白化的现象，如图3，使用不同浓度FSM喷施后，烟草黄白苗所占比例有所不同，用75μmol/L喷施后，黄苗率达到67.5%，用100μmol/L