不同培养方法和细胞因子对小鼠生精细胞的增殖分化效应-妇产科学专业论文.docxVIP

安徽医科大学硕士学位论文 安徽医科大学硕士学位论文 PAGE PAGE 10 英文缩略词表 英文缩写 英文全称 中文全称 DMEM/F12 PBS FBS P19 TP1 FSH T EGF SCF FCM RT-PCR PGD ART IVF ICSI ROSI ELSI d h min dulbecco’s modified eagle’s medium/ham Fl2 phosphate buffered saline fetal bovine serum phosphoprotein 19 transition protein 1 follicle stimulating hormone testosteone epidermal growth factor stem cell factor flow cytomctry reverse transcription-polymerase chain reaction preimplamation genetic diagnosis assisted reproductive technology in vitro fertilization intracytoplasmic sperm injection round spermatid injection elongated spermatid injection day hour minute DMEM/F12 培养基 磷酸盐缓冲液 胎牛血清 磷蛋白-19 过渡蛋白-1 卵泡刺激素 睾酮 表皮生长因子 干细胞因子 流式细胞分析 逆转录聚合酶链反应 植入前遗传学诊断 辅助生殖技术 体外受精 单精子卵胞浆内注射术 圆形精子细胞注射术 长形精子细胞注射术 天 小时 分钟 不同培养方法和细胞因子对小鼠生精细胞 的增殖分化效应 中文摘要 第一部分 不同培养方法对小鼠生精细胞的增殖分化效应 目的：比较曲细精管片段培养和混合细胞共培养两种不同方法对小鼠生精细胞的 增殖分化效应，旨在建立一个高效、稳定的小鼠生精细胞体外培养方法，获得更 多接近成熟的单倍体精子细胞。方法：对7~8天龄小鼠生精细胞分别进行曲细精管 片段培养和混合细胞共培养，通过细胞形态学观察、存活率和粗线期精母细胞特 异性基因P19、单倍体精子细胞特异性基因TP1检测及染色体倍性分析，比较两种 培养方法生精细胞的存活、增殖以及分化情况。结果：曲细精管片段培养法第10~12 天可见到圆形精子细胞，13~14天出现少量带鞭毛的精子细胞或长形精子，第10天 可检测出单倍体峰和单倍体精子细胞特异性基因TP1表达；混合细胞培养法5~7天 可见圆形精子细胞，第5天即可检测出单倍体峰和单倍体精子细胞特异性基因TP1 表达，8~10天少量精子细胞长出鞭毛或胞体渐变成长形。混合细胞培养法所获细 胞数、存活率及单倍体精子细胞分化率均显著高于曲细精管片段培养法(P0.05)。 培养过程中，各级生精细胞随培养时间延长，存活率逐渐降低，细胞数减少，曲 细精管片段培养和混合细胞培养分别在第3周和第4周出现大部分生精细胞和支持 细胞脱落死亡。结论：曲细精管片段培养和生精细胞-支持细胞共培养均可获得单 倍体精子细胞，较之曲细精管片段培养法，混合细胞共培养法存活率更高，可更 早获得更多单倍体精子细胞。 第二部分 EGF和SCF对小鼠生精细胞的体外增殖分化效应 目的：通过在生精细胞体外培养过程中添加不同浓度表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和干细胞因子(stem cell factor，SCF)，探讨两种细胞因子对生 精细胞增殖、分化的最佳作用浓度以及它们之间的最佳组合浓度。方法：对 7~8 天龄小鼠生精细胞进行混合细胞体外培养，在培养基中分别添加不同浓度的 EGF 和 SCF（分别为 5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml、100 ng/ml），并进行 EGF 和 SCF 的交互实验，通过细胞形态学观察、存活率和粗线期精母细胞特异性基因 P19、单倍体精子细胞特异性基因 TP1 检测及染色体倍性分析，探讨 EGF 和 SCF 对生精细胞的体外增殖分化效应。结果：加入 EGF 或 SCF2-4 天，各浓度组中可 见不同程度增殖呈团或链状的细胞团紧密连接，以 EGF 20ng/ml 组和 SCF 40ng/ml 组较为明显，第 5-7 天出现圆形精子细胞，8-10 天少部分精子细胞长出鞭毛或渐变 成长形精子细胞，第 4 周出现大部分生精细胞和支持细胞脱落死亡。培养第 7 天， EGF 浓度为 20ng/ml、SCF 浓度为 40ng/ml 时生精细胞数和存活率显著高于与其它 各浓度组（P0.05），且浓度为 40ng/ml 的 SC