不同溺死类型大鼠肺组织中应激相关基因的表达水平研究-法医学专业论文.docxVIP

山西 山西医科大学硕士学位论文 I I 不同溺死类型大鼠肺组织中应激相关基因的 表达水平研究 摘 要 目的： 水中尸体死因的鉴定一直是法医学领域的难点。生前入水与死后入水是水中尸 体死因的两个类别。其中生前入水即溺死又可分为典型溺死与非典型溺死（干性溺 死）两种。目前，溺死的法医学鉴定主要是在排除其他死因的基础上综合尸体征象 与实验室检测作出判断，并无一个明确特异的金标准。典型溺死尸体征象明显，鉴 定方法多样，但实际案例中检出率并不高。非典型溺死由于死亡机制特殊，时间过 程短，所以尸体征象往往不明显，易与死后抛尸入水混淆。刑事案件中，区分生前 入水与死后入水是明确案件性质的关键。在尸体征象不明显时，如有一种方法可以 将典型溺死与干性溺死明确区分，排除易于混淆的一种，那么将有助于进一步区分 生前入水与死后入水。由于非典型溺死与典型溺死死亡机制与过程并不相同，入水 后发生的应激反应也不相同，进而参与调节应激反应的应激相关基因必然有所差 异。本课题组建立了非典型性溺死与典型溺死两种大鼠模型，依照人类应激基因库 选取了 88 种大鼠应激相关基因，在前期对管家基因稳定性研究的基础上选取了 6 种管家基因作为内参照基因，使用实时荧光定量 PCR 技术相对定量检测两种模型大 鼠肺组织内 88 种应激相关基因的差异表达，希望能够发现一种或多种可以特异性 区分两种死因的应激相关基因，作为鉴别非典型溺死与典型溺死的生物标志物。 方法： 1.研究对象：成年雄性 SD 大鼠 8 只，质量 150g~220g，由山西医科大学动物实 验中心提供。将 8 只大鼠随机分为两组，即非典型溺死组（实验组）与典型溺死组 （对照组）。对照组大鼠投入水桶中至溺死捞出，实验组大鼠投入水桶中至大鼠鼻 部第一次进入水中后将其捞出，迅速给予颈椎脱臼法处死（桶中水面高度约高于大 鼠身长加尾长总和 10 cm，并且水面高度约低于容器边缘至少 10 cm；水为室温下 II II 放置 2—3 d 的自来水，水温 10℃)。解剖大鼠，取其靠近右心室部位肺组织 5g，放 入装有 1ml RNAlater 的取样管中备用，－70℃低温冰箱保存。 .试验方法：组织提取 RNA；RNA 反转录为 cDNA 第一链；分别设计引物， 通过实时荧光定量 PCR 检测 8 例大鼠肺组织中 88 种应激相关基因和 6 种常用的管 家基因的 Ct 值。 .统计学处理：实验所得数据采用均数±标准差表示，使用 SPSS13.0 软件进行 统计学分析，多样本均数比较采用方差分析，各组数据两两比较采用 t 检验。 结果： 1.本实验动物模型建立过程中，8 只大鼠均在入水 10~13min 后鼻部第一次呛水， 典型溺死组大鼠从鼻部第一次呛水至大鼠在水中溺亡，平均耗时大于 5min。随后大 鼠尸体解剖观测到，非典型溺死组大鼠肺组织无肉眼可见的水性肺气肿，切面无溺 液流出，胃腔内无溺液存在，该模型为有效模型。 2. 6 种管家基因中 GAPDH 基因在多个样本中未检测到，故在进行数据统计时 排除。其余 5 种管家基因（B2M、HMBS、HORT1、OAZ1、ACTB）稳定性好，经 两组组间差异性检验，P 值均大于 0.05。 3.选取的 88 种应激相关基因在两组的表达均不相同。组间表达差异倍数较大 （绝对值＞2）的有 25 个，分别是 HRH1、JUN、CCL2、HSPB7、HDAC5、HDAC6、 CXCL2、HSPB2、EP300、CCR4、CXCL10、CCL7、CCL5、STAC、HDAC4、MAP2K7、 CIDEB、IL9、IL13、IL5、IL1A、CD40LG、HSPB3、SCARA5、FOS；差异表达有 统计学意义（P＜0.1）的基因共有 13 个，分别是 CCL2、CECPB、IL1A、IL13、 CD40LG、MAPK1、IL1B、LIG1、CCL7、TAF1、DGKK、CXCL1、CCR2。表达 差异倍数较大且有统计学意义的基因共有 5 种，分别是 CCL2、CCL7、IL1A、IL13、 CD40LG。 4.将 13 种组间有显著性差异表达（P＜0.1）的基因加入数据库进行 GO term 富 集分析，结果显示，这 13 种基因的主要功能体现在四个层面:一是对细胞因子活性、 免疫应答和损伤应答的调节，对应的基因为 CXCL1, CCL2, CD40LG, CCR2, IL1B, IL1A, CCL7；二是对大分子合成的正向调节和大分子代谢过程的正向调节，对应的 基因为 MAPK1、TAF1、CEBPB、CD40LG、 IL1B、IL1A；三是调控细胞增殖， PAGE PAGE III 对应的基因为 CEBPB、CCL2、CD40LG、 IL1B；四是对胞外空间的调节，对应的 基因为