小鼠原钙黏蛋白多样性分析及其亚型克隆与表达.docVIP

小鼠原钙黏蛋白多样性分析及其亚型克隆与表达 　　摘要：原钙黏蛋白（protocadherin）是广泛分布于中枢神经系统的一类跨膜蛋白，是钙黏蛋白家族中最大的亚族。成簇Pcdh基因包含3个串联的基因簇――Pcdhα、β、γ，其中Pcdhα和γ分别由14个和22个可变区及各自共同的恒定区组成。这种特殊蛋白结构决定了原钙黏蛋白各亚型在功能上既相似又不完全相同，为了系统研究原钙黏蛋白各个亚型的功能，本研究对原钙黏蛋白家族氨基酸序列保守性进行了系统性分析，并据此设计特异性的引物来完成原钙黏蛋白各个亚型的克隆；并以原钙黏蛋白α1基因为例，通过PCR方法成功将其从小鼠大脑中克隆并构建到带有Myc标签的真核表达载体pcDNA3.1上；利用脂质体转染方法将该基因成功表达于293T细胞。本研究结果将为后续其他亚型的克隆建立技术平台。 　　关键词：原钙黏蛋白；基因；克隆；小鼠；亚型；氨基酸序列 　　中图分类号：Q785文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）11-0034-03 　　根据原钙黏蛋白在基因组上的排布可以分为非成簇原钙黏蛋白和成簇原钙黏蛋白，成簇原钙黏蛋白在神经系统中大量表达，是钙黏蛋白超家族中最大的一个亚家族[1]。成簇原钙黏蛋白包含3个串联基因簇――α、β、γ[2]。其中原钙黏蛋白α和γ分别由14个和22个可变区及各自共同的恒定区组成，并通过基因的可变剪接编码成36种原钙黏蛋白分子，而原钙黏蛋白β的22个成员仅分别由1个外显子编码而成[2]。研究表明，原钙黏蛋白在神经突触发育过程中起直接作用，作为黏附分子加强神经突触的连接，在突触特异性形成过程中也发挥重要作用[3]。原钙黏蛋白根据其胞内段的差异可以分为A类型和B类型，A类型在调节学习记忆和海马5-羟色胺总量上起重要的作用[4]，原钙黏蛋白α和γ负调控PYK2活性，依赖胞内区与PYK2结合[5]，并通过PYK2-RhoGTPase通路调节细胞骨架从而影响神经元树突发育[6]，结果表明，原钙黏蛋白经由调节细胞黏附来建立神经元连接。迄今为止，已经发现大约60多种原钙黏蛋白在中枢神经系统中表达[7]。原钙黏蛋白与典型的钙黏蛋白一样，由6个胞外EC结构域、跨膜区和胞内区3部分组成，各亚型在结构上高度相似，在氨基酸序列上却不完全相同[2，8]。众多研究结果表明，原钙黏蛋白各个亚型在神经元发育过程中分别发挥着独特的作用。为了系统探索各个亚型的作用，本研究通过软件分析原钙黏蛋白α家族氨基酸序列保守性，以原钙黏蛋白α1基因为例将其构建到pcDNA3.1载体并顺利表达，结果将为原钙黏蛋白其他亚型克隆及其后续功能研究建立技术平台。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　1.1.1细胞和表达载体真核表达载体pcDNA3.1（―）mycHisA购自Invitrogen；293T细胞系由上海交通大学肿瘤所实验室赠送。 　　1.1.2试剂和酶类Tris碱、甘氨酸、过硫酸铵和十二烷基磺酸钠购自Sigma-Aldrich公司。无水乙醇、甲醇、氯化钠、乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸钠等试剂购自国药集团化学试剂有限公司；TRIzolReagent购自Gibco（lifetechnologies）公司；胰化蛋白胨与酵母提取物购自Oxoid公司；RT-PCR试剂盒、电泳级琼脂糖和核糖核酸酶购自Promega公司；质粒小抽和胶回收试剂盒购自Axygen公司；质粒中抽试剂盒购自Qiagen公司。30%Acr/Bis储备胶溶液和封闭用脱脂奶粉，购自Bio-Rad公司；胰蛋白酶和胎牛血清购自Gibco公司；100bpDNALaddermarker、1kbDNALaddermarker购自宝生物工程（大连）有限公司；Opti-MEMI液体培养基、Lipofectamine2000、蛋白markerSeebluePlus2PrestainedStandard购自Invitrogen公司；T4连接酶、限制性内切酶购自NewEnglandBiolabs公司；RIPA细胞裂解液购自碧云天公司。 　　1.1.3引物本试验所用引物由上海生工生物工程技术公司合成上游引物PF：5′-AGCTCGAGCTCGATACGGAAAGTGCAGTAC-3′包含1个XhoⅠ酶切位点。 　　下游引物PR：5′-AGCAAGCTTACACTGGTCACTGTTGTCCGT-3′包含1个HindⅢ酶切位点。 　　1.1.4抗体mouseanti-Myc（Millipore），mouseanti-β-actin（Abcam），mouseanti-protocadherinα由艾比玛特公司定制生产。 　　1.2方法 　　1.2.1总RNA的提取 　　取小鼠大脑组织50～100mg，加1mLTRIzol试剂，在冰上将组织捣碎，12