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小立碗藓CAD1基因敲除载体构建及酶切方法优化 　　摘要： 苔藓植物能否合成木质素目前还存在一定的争议。肉桂醇脱氢酶（CAD）催化木质素单体合成的最后一步反应，Real-Time PCR表达分析表明，小立碗藓CAD1基因在接种灰霉菌后的第2天表达量迅速上升。本试验利用PCR技术，以小立碗藓基因组DNA为模板，使用Primer 5-Cracked设计的引物，扩增出小立碗藓CAD1基因的上、下游同源臂基因片段。酶切CAD1上游同源臂和pTN182原始质粒，经连接酶连接、转化至感受态大肠杆菌，筛选出阳性株。采用裂解液裂解、质粒DNA提取、质粒PCR以及酶切进行验证，得到CAD11-pTN182。采用同样的方法把下游片段转入CAD11-pTN182，即得CAD11-pTN182-CAD12，最后进行测序分析。结果表明，已成功构建CAD11-pTN182-CAD12敲除载体，并将该重组质粒转入目的菌株大肠杆菌中保存备用，可为后续进行小立碗藓CAD1基因敲除，验证小立碗藓CAD1基因功能，进一步了解模式植物小立碗藓防卫反应机理研究奠定良好基础。 　　关键词： 小立碗藓；CAD1基因；基因克隆；载体构建；酶切 　　中图分类号： Q782 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）03-0059-05 　　苔藓植物是高等植物的低等类群，是陆生植物登陆早期的代表，含有一整套合成木质素的基因[1]，具备合成木质素的生理基础，但是苔藓植物能否合成木质素目前还存在一定的争议。小立碗藓（Physcomitrella patens）隶属葫芦藓目葫芦藓科（Funariaceae）小立碗藓属（Physcomitrium）。小立碗藓生活史中单倍体的配子体时期占优势，其整个基因序列已知，核基因组易于与有同源片段的外源DNA发生高频率的同源重组，这使得基因敲除成为可能，并且试验过程中得到的突变体即为纯合体，为基因功能的研究提供了良好的材料[2]，已经成为植物分子生物学研究的模式生物。 　　病原真菌和细菌感染维管束植物时，感染部位的细胞壁加厚并形成突起状结构――乳突。本试验室前期工作中发现灰霉菌感染非维管束植物小立碗藓后，小立碗藓细胞壁加厚或形成乳突结构。形成乳突是维管束植物常见的防卫反应，是限制病原体入侵的一道物理障碍，其主要成分之一为木质素，说明乳突是植物一个较为保守的抗病反应机制。木质素是一种复杂的酚类聚合物，广泛存在于高等植物中的维管束植物中[3]，苔藓植物中是否合成木质素目前还存在一定的争议。相关文献报道，苔藓植物不合成木质素，却合成木酯素或类木质素。用木质素的特异性染料高锰酸钾染色灰霉菌感染的小立碗藓样品并于电镜下观察发现，细胞壁加厚或乳突部位出现明显染色加深，说明小立碗藓在灰霉菌胁迫下可能合成了类木质素。木质素的生物合成是以苯丙酸起始，在一系列酶催化下逐步转化为木质素单体，最终聚合成木质素的过程，其中肉桂醇脱氢酶（CAD）是木质素代谢途径中第一个被研究的酶，其催化木质素单体合成的最后一步反应，将3种肉桂醛还原生成相应的3种肉桂醇[4]。本试验室前期使用 Real-Time PCR表达分析表明，小立碗藓CAD1基因在接种灰霉菌后的第2天表达量迅速上升，达到未接种对照组的17倍。综上所述，小立碗藓中可能合成了类木质素。 　　本试验构建小立碗藓CAD1基因的敲除载体，为后续敲除小立碗藓CAD1基因，获得CAD1基因敲除突变株，验证小立碗藓CAD1基因是否参与木质素的合成奠定基础，对揭示模式植物小立碗藓防卫反应机理有重要意义。 　　1 材料与方法 　　1.1 仪器、试剂与材料 　　1.1.1 仪器 电子天平，美国Denver Instrument MXX-612，TP-214；PCR仪，美国Bio-Rad Engine；电泳仪，美国Bio-Rad A101439；凝胶成像系统，美国Bio-Rad Engine；微量冷冻离心机，日本3500；超净工作台，上海博迅VS-840-2；微电脑光照培养箱，上海博迅SPX-250B-G；101A-3型电热鼓风干燥箱，上海市实验仪器总厂；YXQ-LS-75 SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司；HHS型电热恒温水浴锅，上海博讯实业有限公司；十万分之一分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；TGL-16G型离心机，上海安亭科学仪器厂；85-2A恒温磁力搅拌器，金坛市科析仪器有限公司；精密酸度计，上海大普仪器有限公司。 　　1.1.2 试剂 引物，限制性核酸内切酶（XhoⅠ、EcoRⅤ、XbaⅠ、BamHⅠ）、Premix TaqTM 、T4-DNA连接酶、DNA Marker DL15000，大连宝生物工程有限公司；Plasmid Mini KitⅠ试剂盒，OMEGAbiotek公