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幼胚发育阶段对次郎柿胚抢救效果影响 　　摘要：迄今对柿幼胚培养的最佳时期尚不完全明确。以完全甜柿品种次郎(1)(ospTros hahi Thunb.cv.Jimu)为试材，探讨了幼胚发育阶段对胚抢救效果的影响。结果表明，(1)授粉后加d幼胚处于球形胚期，50d处于心形或鱼雷形期，60 d之后处于子叶形胚期；(2)接种授粉后40 d幼胚的萌发率(29_3％)显著低于其它时期，其后不同取胚时期的萌发率均为100％，差异不显著；(3)接种授粉后60 d幼胚的成苗率(92％)显著高于具它时期，再生植株苗高和生根数与茛它时期无明显差异。因此，心形期至子叶期阶段是完全甜柿品种次郎幼胚的最佳培养时期，萌发率和成苗率分别为100％和86％-92％。该时期较前人报道的柿幼胚培养时期提早10～20 d。 　　关键词：次郎甜柿；胚发育阶段；胚抢救 　　 　　胚抢救是克服果树杂种胚早期败育的有效途径，已在早熟桃[1]、早熟杏[2]等新品种选育，以及无核葡萄[3]等新种质创制中广泛应用。胚抢救技术在利用未减数配子创建无核柿种质[4]，以及利用单性结实性强的亲本(如磨盘柿等)杂交育种[5]中也具有重要价值。研究表明，柿授粉60 d后胚胎发育已经成熟[6]。但前人[5.7-8]报道的柿胚抢救时期为授粉后70 d左右。多年来，我们参考这一时期，采取2n花粉授粉后70 d的次郎幼胚进行胚抢救培养，均未获得预期9倍体再生植株。其原因可能是胚抢救时期过晚，9倍体合子胚由于染色体不均衡在授粉后70 d以前已经退化[4]。为此，以我国广为栽培并常用作育种亲本的完全甜柿次郎为试材，首先观察其授粉后不同时期的幼胚发育阶段，然后探讨接种不同发育阶段幼胚对胚抢救培养再生植物的效果，以期为柿胚抢救技术的有效利用提供科学依据。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　 　　 　　试材为完全甜柿(P0llination-constant non-as－tringent，PCNA)品种次郎(Diospyros　kaki Thunb.cv.Jirou)，授粉品种为禅寺丸(D.kaki Thunb.cv.Zenii-maru)。采自武汉市林业科技推广站郑店品种圃(武汉市江夏区郑店镇)。 　　用标签标记同一天开放的雌花。自授粉后30 d起，每隔10d从幼果中摘取幼胚，在OlympusBH-2型显微镜下解剖并观察幼胚发育情况，并摄影记录。 采集授粉后40、50、60、70和80 d幼果，参考谷晓峰等[7]方法在超净上作台上取幼胚并接种到附加ZT 0.44 mg/L、IBA 0.3 mg/L、AC 3.0g/L、70.0g/L蔗糖和8.0 g/L琼脂的MS(1/2N)培养基上。暗培养4 d后转到恒温28℃、光照14 h、光照强度31.2-39.0μmol/m2?s条件下培养。每处理接种40-60个胚，重复3次。 　　幼胚接种1个月后统计萌发率和成苗率，培养6周后测定再生植株苗高和根数。方差分析采用SPSS分析软件。 　　 　　2　结果与分析 　　 　　 　　2.1　胚胎发育阶段的观察 　　授粉后30 d内在显微镜下未观察到胚。此后观察到胚的几个发育时期(图1)。授粉后40d可见球形胚(图1-A)；授粉后50 d观察到一些幼胚处于心-形期，一些幼胚处于鱼雷形期(图1－B，C)，可能是胚个体差异造成幼胚发育阶段的不同；授粉后60-80 d胚均为子叶形，其子叶随着时间延后而长大(图1-D)。球形期胚很小(lmm)，胚和胚乳均呈半透明状，近无色，肉眼难于将2者区分，不利于完整胚的剥取。心形期以后的胚颜色为白色，肉眼可将胚和胚乳区分。80 d以后胚体增大不明显，胚乳开始硬化，取胚时易损伤子叶。 　　 　　2.2　取胚时期对幼胚萌发率的影响 　　不同取胚时期影响胚的萌发率(表1)。授粉后40 d幼胚萌发率显著低于其它时期，未萌发的胚多保持接种时状态，无分化迹象。球形期以后的胚均可全部萌发，但从接种到萌发所需时间逐渐变短。其中，授粉后40 d幼胚萌发需20 d，且胚生长缓慢，分化的子叶为白色、边缘皱缩。授粉后50 d幼胚接种10 d后，胚根伸长并分化出根，15 d后子叶和根生长较快，子叶由淡黄转为绿色。授粉60 d以后幼胚子叶已经形成，其萌发所需时间短，接种5 d后子叶翻卷、1周后胚根向下弯曲分化出根(图2-A)。之后子叶和下胚轴迅速伸长，子叶颜色由原来的白色变成淡绿色，20 d左右长成完整植株。 　　 　　2.3　取胚时期对胚成苗率的影响 　　 　　幼胚萌发后继续培养可长成完整植株(图2-B)。不同取胚时期对次郎幼胚培养的成苗率有较大影响(表1)，随着取胚时期的推后，成苗率逐渐提高。授粉后40 d幼胚。成苗率最低；50、70、80 d龄胚的差异不显著，成苗