微囊藻毒素―LR诱发甲状腺毒性对斑马鱼胚胎发育影响.docVIP

微囊藻毒素―LR诱发甲状腺毒性对斑马鱼胚胎发育影响 　　摘要：研究了微囊藻毒素-LR（MC-LR）对斑马鱼的毒性，将受精后的斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的MC-LR（0、0.6、1.2和2.4 mg/L）。结果表明，144 h后斑马鱼生长受到抑制、体长显著降低，同时其下丘脑-垂体-甲状腺轴（HPT）相关基因的表达模式也发生了显著变化。MC-LR可能通过调节HPT轴重要基因的表达来干扰甲状腺激素的分泌，继而干扰鱼类胚胎的生长发育。 　　关键词：微囊藻毒素-LR；斑马鱼；胚胎；HPT轴 　　中图分类号：TS212.4；TS207.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）24-6525-04 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.24.050 　　随着人类社会生产力的提高及人口压力的增大，淡水水体富营养化现象日趋严重，蓝藻水华频繁发生。蓝藻水华次生代谢产生的多种毒素对人和动物的机体健康带来了巨大威胁。在已发现的各种蓝藻毒素中，微囊藻毒素（Microcystins，MC）是一种在蓝藻水华污染中产生量大、出现频率高和造成危害严重的藻毒素种类。至今已发现MC有80多种异构体[1]，在众多异构体中，毒性较大、存在较普遍、研究较详细的是MC-LR（L、R分别代表亮氨酸、精氨酸）[2，3]。 　　研究发现，MC对鱼类的内分泌系统具有干扰作用，可以干扰鱼类甲状腺激素分泌，引发鱼类内分泌系统紊乱以及鱼类生长发育迟缓[4，5]，然而，有关MC干扰甲状腺机能的分子机制研究还非常匮乏。甲状腺是脊椎动物非常重要的腺体，属于内分泌器官，其分泌的甲状腺激素具有调节动物体生长、发育、繁殖、机体代谢的重要作用。甲状腺的功能与碘吸收，激素的合成、转运，脱碘以及甲状腺激素受体有很大关系[6]。哺乳动物下丘脑分泌促甲状腺激素释放激素（TRH）、刺激垂体分泌促甲状腺激素（TSH），继而TSH刺激甲状腺分泌甲状腺激素，这个体系构成了下丘脑-垂体-甲状腺轴（HPT轴）（图1）。HPT轴信号通路关键基因的表达是调控甲状腺功能的重要因子。 　　与成年鱼类不同，胚胎对MC更敏感，而且MC引起的胚胎发育迟缓效应可造成不可逆的损害，影响到各个阶段的生长发育，而引发自然水体中鱼类种群的退化。已有的MC对胚胎发育影响相关的试验多属于描述性试验，缺乏对其内在机制的揭示，也缺乏有效的预警手段。本研究拟通过研究斑马鱼HPT轴关键基因对MC染毒的响应，筛选MC干扰甲状腺机能的标志性基因，扩展对MC的甲状腺致毒机理的认识，可以评估MC对鱼类乃至人类的潜在威胁，为防治MC的内分泌毒性提供新的思路和理论依据。 　　1 材料?c方法 　　1.1 材料与试剂 　　微囊藻毒素MC-LR购自台湾Express公司，经LC-10A型高效液相色谱（日本岛津公司）检测，纯度≥95%。 　　三卡因（MS-222）水溶液用于麻醉斑马鱼幼体，购自美国Sigma-Aldrich公司。其他化学试剂均为分析纯，电泳所使用的化学试剂均购自美国Biosciences公司。 　　1.2 斑马鱼的饲养和胚胎毒性试验 　　斑马鱼的饲养以及胚胎的采集参考文献[7]。将野生型斑马鱼饲养在封闭的流动体系中，维持水温（28.0±0.5） ℃，光照14 h、黑暗10 h的光照周期。斑马鱼用卤虫无节幼体饲养，每日2次。在水箱中放置大约20条雄性成鱼和10条雌性成鱼，在大量产卵后收集受精卵。受精后0.5～1.0 h，剔除发育异常的胚胎，选择正常发育的胚胎随机分组在烧杯中，每个烧杯30个胚胎。烧杯中添加浓度梯度为0、0.6、1.2和2.4 mg/L的MC-LR，并添加50 mL培养液，包含0.2 mmol/L Ca（NO3）2、0.13 mmol/L MgSO4、19.3 mmol/L NaCl、0.23 mmol/L KCl和1.67 mmol/L HEPES[8]。胚胎染毒时间持续到受精后144 h，大多数胚胎器官在这个时候已经发育完全。每个浓度设3个平行，每个平行都在玻璃烧杯中添加50 mL培养液和30个发育正常的胚胎，选择正常发育的幼体来进行后续试验。 　　1.3 基因表达检测 　　经MC-LR暴露后，收集幼体并于-20 ℃保存在TRIzol试剂中，每个处理浓度取30个幼体的混合物做3个重复进行测定。离析、纯化及测定总RNA、第一单链cDNA的合成、实时定量PCR（QPCR）等按照Li等[9]的操作执行，用TRIzol regent提取总RNA、RNase-free DNase I消解。在260 nm下估算总RNA的浓度，并通过测定260 nm/280 nm的比值来验证其质量。1%的琼脂-甲醛凝胶电泳并由溴化乙锭（EB）染色，以进一步纯化提取的总RNA。第