微生物转化去氢表雄酮生成7琢 15琢―二羟基雄烯醇酮研究.docVIP

微生物转化去氢表雄酮生成7琢 15琢―二羟基雄烯醇酮研究 　　摘 要：7α，15α-二羟基雄烯醇酮是合成屈螺酮的重要中间体，应用亚麻刺盘孢（Colletotrichum lini AS 3.4486）的羟化酶体系对去氢表雄酮（DHEA）底物进行转化，合成7α，15α-二羟基雄烯醇酮。文章采用平板筛选、投料方法、发酵过程的控制，在去氢表雄酮（DHEA）投料浓度10 g/L的条件下，转化率可达80%以上，主要产物为7α，15α-二羟基雄烯醇酮。比原来的投料浓度有较大的提高。 　　关键词：去氢表雄酮；亚麻刺盘孢；7α，15α-二羟基去氢表雄酮；微生物转化工艺 　　中图分类号：R977.1 文献标识码：A 文章编号：1006-8937（2016）33-0211-03 　　1 概 述 　　随着甾体化学的飞速发展，甾体激素类药物已逐渐成为医药领域的重要门类。屈螺酮是一种高效、低毒、副作用小的新一代女用避孕药。由于屈螺酮具有广阔的市场前景，其前体化合物7α，15α-二羟基去氢表雄酮也受到广泛关注。之前合成7α，15α-二羟基雄烯醇酮主要使用化学方法，由于化学法合成7α，15α-二羟基雄烯醇酮步骤繁琐，产物收率低，对人和环境影响大。 　　20世纪70年代德国先令首先将生物转化法用于屈螺酮的合成，利用微生物的羟化酶体系，在去氢表雄酮的C7和C15位引入羟基，得到7α，15α-二羟基去氢表雄酮，再经化学法合成屈螺酮。使用微生物法引入羟基缩短了屈螺酮的合成路线，但其转化效率较低。目前对去氢表雄酮转化效率比较高的菌株主要来自Colletotrichum lini属，但高浓度的DHEA对具有菌种具有毒害作用，因此寻找耐受性强、转化率高、生命力强的菌种非常重要。 　　由于丝状真菌的细胞壁成份复杂，直接以孢子或菌丝进行诱变比较难。本实验通过孢子稀释培养筛选生长速度快的菌种，选择加料溶剂、以及添加表面活性剂和各种转化条件的控制，达到最佳培养条件以提高投料浓度和转化率。 　　2 材料与方法 　　2.1 菌 种 　　亚麻刺盘孢由本实验室保存 　　2.1.2 培养基 　　斜面培养基PDA（g/L）：土豆200，葡糖糖20，琼脂20，pH自然 　　种子（发酵）培养基（g/L）：葡糖糖30，玉米浆10，磷酸二氢钾1，磷酸氢二钾2，硫酸镁0.244，泡敌适量 　　2.1.3 试 剂 　　DHEA，7α，15α-二羟基去氢表雄酮，7α-羟基去氢表雄酮由本实验室分离制备。培养基各种营养成分购置上海试剂公司，投料使用的各种溶剂为工业级，分析使用试剂均为分析纯。 　　2.1.4 使用仪器 　　菌种培养箱（上海博讯实业有限公司SPX-150B-Z型），恒温摇床（上海世平的SPH-211C），台式离心机（TGL-16C高速离心机），立式电热压力蒸汽灭菌锅（上海申安LDZX-75KBS），菌种保藏（杭州华日电冰箱股份有限公司），超净工作台（苏州净化有限公司），显微镜， 高效液相色谱。 　　2.2 试验方法 　　2.2.1 生长速率快菌种筛选 　　PDA培养基的配置，土豆去皮称取200 g，切成小块置烧杯中加水1 000 ml，煮沸5～10 min，用纱布滤去土豆块，加水补充蒸发水分，加入20克葡萄糖和20克琼脂溶解，分装灭菌。灭菌之后均匀的倾到于平皿，冷却凝固，28 ℃培养2天备用。取保存菌种用无菌水洗下孢子，吸取1 ml加入到装有9 ml无菌水的试管中，为101，混合均匀之后按同样方法稀释，直至1010，取104～108每级涂布5个平皿，29 ℃培养。 　　2.2.2 生长速度快菌株的扩培 　　选择平皿中生长速度快，颜色深的菌落，扩培到茄形瓶中，29 ℃培养，待种子成熟之后，保存于冰箱。 　　2.2.3 孢子悬浮液的培养 　　将无菌水加入亚麻刺盘孢霉菌茄形瓶保藏培养基中，用接种环轻轻刮取表层孢子，将洗下的孢子悬浮液置于无菌的盛有玻璃珠的三角瓶内，打散孢子悬浮液约20 min。用血球计数板计算孢子悬浮液的浓度。将计数后的悬浮液于4 ℃冰箱内保藏。尽量保证优化过程中每瓶菌种生长状态一致。 　　2.2.4 亚麻刺盘孢生长曲线的测定 　　采用过滤法测定菌体的生物量。取24个容量为500 ml的摇瓶，注明培养时间，分别准确加入100 ml种子培养液，120 ℃灭菌30 min。接种前置无菌室开紫外灯30 min，向每瓶培养基中分别加入1 ml孢子悬浮液，29 ℃、160 rpm/min培养。 　　从开始培养每隔4 h取2瓶，用恒重的滤纸抽滤菌体，至真空抽不在滴水，弃去滤纸称其重量即为菌体的重量。取2瓶的平均值，以时间为横坐标，菌体量为纵坐标，得到亚麻刺盘孢的生长曲线。 　　2.2.5 种子液的培养 　　按种子培养基配方配置种子培养基