苯丙酮尿症新生儿血斑中辅酶及葡萄糖等物质的分析.docVIP

苯丙酮尿症新生儿血斑中辅酶及葡萄糖等物质的分析 　　摘要苯丙酮尿症（PKU）是新生儿先天性苯丙氨酸羟化酶缺陷所引起的苯丙氨酸代谢障碍疾病。本研究采用超高效液相色谱质谱联用技术，测定了5例PKU新生儿出生3天和出生30天后的血斑与20例年龄相仿的正常新生儿血斑中辅酶Q10的绝对含量和辅酶Q9的相对含量，其中，健康新生儿血斑中辅酶Q10的含量为（122.1±24.9）ng/mL，PKU新生儿组的含量为（59.0±12.0）ng/mL。采用气相色谱质谱联用技术测定了胆固醇和葡萄糖的相对含量。研究结果表明，与对照组相比，PKU新生儿血斑中辅酶Q10、Q9、胆固醇和葡萄糖的含量均显著降低，辅酶Q10的降低与血斑中苯丙氨酸含量升高呈现显著反向相关。本研究结果为PKU患儿的饮食治疗方案提供了依据。 　　关键词苯丙酮尿症；辅酶Q10；胆固醇；葡萄糖 　　1引言 　　苯丙酮尿症（Phenylketonuria，PKU）是一种由于肝脏苯丙氨酸羟化酶（PAH）缺乏或活性减低而导致苯丙氨酸代谢障碍的常染色体隐性遗传性疾病。辅酶Q10（CoQ10）是一种小分子醌类化合物，主要参与线粒体氧化磷酸化过程，在营养物质在线粒体内转化为能量的过程中起重要作用，且有明显的抗脂质过氧化作用[1，2]。人体的所有细胞中都存在CoQ10[3]，在哺乳动物体内存在有辅酶Q9（CoQ9）[4]。CoQ10在个体中含量差异主要受饮食和疾病的影响[5]，人体的血液和生物组织中，90%以上CoQ10是还原型[1，6，7]。Artuch等[8]在1999年首次报道了PKU患者体内CoQ10含量降低，通过饮食治疗的PKU患儿与相应年龄的正常对照组相比，血清中的CoQ10含量显著降低。随后的研究发现，PKU患者血清中CoQ10降低主要是由于苯丙氨酸（Phe）含量升高[9]。 　　苯丙氨酸有抑制胆固醇合成的作用[10，11]。Hughes等[12]发现，血清中CoQ10的降低与血清中的胆固醇水平有关。在PKU患儿病症与CoQ10和胆固醇等含量关系的研究中，目前的研究对象均为饮食治疗或控制的PKU患儿与相应年龄的正常儿童，然而由于血浆/血清中的CoQ10受饮食影响较大，所以无法确定其差异变化源于疾病本身，还是由于饮食差异。 　　人血清CoQ10的分析方法有色谱分析法、分光光度法、比色法[13]、电化学分析法[14]和电泳法[15]，其中反向液相色谱分析应用最为广泛，所使用的检测器主要有紫外检测器[16]、电化学检测器[17，18]和质谱检测器[19～25]，其中质谱检测的选择性和高灵敏度高。本研究采用超高效液相色谱与三重四极杆质谱联用技术，进行新生儿血斑中CoQ10的定量分析和CoQ9的半定量分析，采用气相色谱质谱联用技术（GCMS）测定胆固醇和葡萄糖，研究了PKU新生患儿与正常新生儿之间的CoQ10、胆固醇以及葡萄糖含量差异。 　　2实验部分 　　2.1实验对象 　　PKU新生儿与正常新生儿血斑均来自吉林省妇幼保健院（已签署知情同意书，并经伦理委员会同意），实验中使用SS903滤纸进行新生儿血斑采集，正常新生儿组包括20例出生3天后的新生儿血斑，PKU新生儿组包括5例出生3天与出生30天未经饮食治疗的PKU新生儿血斑。使用1296071Delfia血斑打孔器（PerkinElmer公司）在滤纸片上采集直径为3.2mm的圆形血斑（相当于3.4μL血液，可以保证每片血斑中的血液含量是一致的[27]）。血斑在检测辅酶含量前，需在室温晾干处理至少24h；或将样品于4℃保存待测。 　　2.2仪器与试剂 　　WatersXevoTQ质谱仪（英国Micromass公司），电喷雾离子源，数据采集使用MassLynx4.1采集软件和处理软件（Waters公司，Manchester公司，英国）；AcquityUltraPerformanceLC超高效液相色?V系统（美国Waters公司），配有自动进样器。6890Nnetworld气相色谱系统（美国AgilentTechnologies公司），配5975inertXLMassselectivedetector质谱检测器，7683seriesG2614AN279自动进样器。 　　CoQ10、CoQ9、CoQ4，色谱级氨水和氟化铵（美国SigmaAldrich公司）；甲醇（色谱纯，美国Tedia公司）；葡萄糖标准品（D（+）Glucose，minimum99%GC，美国Sigma公司）；其余试剂均为分析纯。实验用水为超纯水（MilliQ，比利时Millipore公司）。 　　2.3质谱条件和色谱条件 　　质谱条件：采用正离子模式，多反应离子监测模式进行检测，锥孔电压和碰撞电压通过Intellistart功能进行优化。离子源电压为3.