自体hcn2-mscs希氏束内移植治疗完全性房室传导阻滞的实验分析-experimental analysis of complete atrioventricular block treated by autologous hcn 2 - mscs transplantation in his bundle.docx

PAGE PAGE 3 PAGE PAGE 4 自体HCN2-MSCs希氏束内移植治疗完全性房室传导阻滞的实验研究 摘 要 目的 本课题将细胞移植与基因治疗相结合，将携带 HCN2 基因的骨髓间充质干细胞 （mesenchymal stem cells, MSCs）自体移植入完全性房室传导阻滞动物模型的希氏 束损伤区，探索治疗完全性房室传导阻滞的新方法。 方法 （一）猪 MSCs 的分离、培养与鉴定 获取实验猪骨髓，密度梯度离心后以流式细胞仪分选培养 MSCs，每 72 h 换液 1 次，细胞融合达 90%传代培养；观察培养细胞的形态学特点，绘制细胞生长曲线 并计算细胞倍增时间；通过流式细胞仪检测细胞表面标志 CD105、CD73、CD90、CD45、 CD34、CD14 及 CD19；将 MSCs 置入成脂肪、成骨、成软骨诱导培养基进行诱导分 化并鉴定分化细胞的性质。 （二）Ad.HCN2-GFP 转染 MSCs 构建起搏细胞 构建 Ad.HCN2-GFP 并测定滴度，转染 Hela 细胞以确定其安全性；Ad.HCN2-GFP 以不同感染倍数（multiplication of infection，MOI）转染 MSCs 后检测转染效率，确 定最佳 MOI；流式细胞仪检测检测 MSCs 感染 Ad.HCN2-GFP 后 HCN2 表达率并绘制 时间曲线；检测 Ad.HCN2-GFP 转染 MSCs 后细胞活力与细胞倍增时间的变化；免疫 荧光检测 HCN2 通道蛋白表达；全细胞膜片钳技术行电生理学检测；分离培养乳鼠 心肌细胞（neonatal rat’s cardiomyocytes, NRCs）并行免疫组织化学鉴定；联合培养 转基因 MSCs 和 NRCs，观察细胞搏动情况并记录收缩频率并行抗缝隙连接蛋白 43 （Connexin 43，Cx43）免疫荧光染色。 （三）自体起搏细胞希氏束内移植治疗完全性房室传导阻滞 实验猪在全麻机械通气下，经胸射频消融希氏束建立完全性房室传导阻滞动物 模型；实验组将 Ad.HCN2-GFP 转染的自体 MSCs 移植于希氏束损伤区域，阳性对照 组将 Ad.HCN2-GFP 转染的自体 MSCs 移植于右室前壁内，阴性对照组将 Ad.GFP 转染 的自体 MSCs 移植于希氏束损伤区域；术后给予临时起博器保护，1 周后去除起搏 器，常规行体表心电图和 24 h 动态心电图检查；行超声心动图检查以明确心脏射血 功能及收缩同步情况；对细胞移植部位的希氏束心肌标本行 HE 染色及抗 Cx43 免疫 荧光染色。 结果 （一）猪 MSCs 的分离、培养与鉴定 第 第二军医大学博士学位论文 自体 HCN2-MSCs 希氏束内移植治疗完全性房室传导阻滞的实验研究 从骨髓分离得到的MSCs活细胞百分率为 94.2％。倒置相差显微镜下观察，刚接 种的细胞在倒置相差显微镜下体积较大，呈球形，悬浮于培养液中。大小不一，胞体 透亮且折光性强。3 h后开始贴壁，16 h贴壁细胞明显增多，48 h后大部分细胞已贴壁。 经流式细胞仪分选传代后，生长较快，2 h内即开始贴壁，8 h后基本贴壁，24 h内完 全贴壁，3-4 d后细胞基本融合，约7天可传一代。连续传9至10代，细胞的形态无明显 变化。MSCs生长的第3、5、10代，细胞生长曲线均呈S状。第3、5、10代MSCs的细胞 倍增周期分别约为36，38和48小时。流式细胞仪检测结果显示MSCs对CD105、CD73、 CD90表达均为阳性，CD45、CD34、CD14及CD19表达弱阳性。MSCs在不同的诱导环境 下，可分化成脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。 （二）Ad.HCN2-GFP 转染 MSCs 构建起搏细胞 成功构建重组腺病毒 Ad.HCN2-GFP，滴度为 1.5 × 109 pfu/ml。HeLa 细胞未出现 致细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）。以 Ad.HCN2-GFP 转染 MSCs 后，48-72 h 后荧光显微镜下可见细胞呈绿色荧光。不同的 MOI 值得到不同的转染效率。随着 MOI 值的增加，GFP 阳性细胞比率也增加，显微镜下细胞表达绿色荧光更强。 MOI=100 时，MSCs 转染率约为 95%，同时细胞状态明显优于 MOI=150、200 的细胞 状态。Ad.HCN2-GFP 转染 MSCs 后行抗 HCN2 免疫荧光染色，荧光显微镜下可见荧光， 证实有 HCN2 蛋白表达。转染后第一周、第三周、