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拉帕替尼联合帕比司他对乳腺癌细胞生长增殖影响 　　摘要：目的：观察拉帕替尼联合帕比司他对乳腺癌细胞生长增殖的影响，并初步探讨其作用机制。方法：体外培养乳腺癌细胞系SK-BR3细胞，给予不同浓度的拉帕替尼和（或）帕比司他作用72h，MTT法观察细胞的增殖情况，流式细胞术检测sub-G1期细胞的比例，Western blot观察磷酸化H2A.X的含量以及PARP的水平。结果：随着拉帕替尼和帕比司他剂量的增加，各自单药及联合使用对SK-BR3细胞的生长抑制作用逐渐加强。当两者联合使用对SK-BR3细胞抑制率为50%时，拉帕替尼和帕比司他的联合系数为0.90。单纯给予3μmol/L 拉帕替尼处理SK-BR3细胞对sub G1期细胞比例无明显影响。给予10～15nmo/L 帕比司他对sub G1期细胞比例无显著改变，但给予3μmol/L拉帕替尼和10～15nmol/L帕比司他共同作用后，细胞比例显著增高，同时，磷酸化γ-H2A.X和PARP含量也显著增高。结论：拉帕替尼联合帕比司他对乳腺癌细胞生长增殖具有协同作用，这可能与诱导其凋亡有关。 　　关键词：拉帕替尼;帕比司他;乳腺癌 　　乳腺癌是威胁女性健康的主要恶性肿瘤之一，近年来，靶向治疗是治疗乳腺癌的热点。拉帕替尼（lapatinib，LAP）是一种小分子酪氨酸激酶抑制剂。研究显示，LAP可有效地抑制EGFR/Her2信号通路，同时也能抑制Ras通路和PI3K通路，从而诱导细胞凋亡[1]。帕比司他（panobinostat，LBH589）是一种组蛋白新型有效的去乙酰化酶抑制剂LBH589（Histone deacetylase inhibitors，HDACi），可促进组蛋白乙酰化，激活某些基因转录，抑制细胞生长、阻滞细胞周期及诱导细胞凋亡，从而达到抗肿瘤的目的，并且对多种药物具有协同作用[2，3]。本研究拟以人类乳腺癌细胞系SK-BR3作为研究对象，试图研究LAP和LB589对乳腺癌细胞增殖和细胞周期的影响，并初步探讨可能的机制。 　　1 材料与方法 　　1.1主要实验试剂 　　 帕比司他购自Novartis Pharmaceuticals，拉帕替尼购自LC Laboratories，SK-BR3购自中科院上海细胞库，BCA试剂盒购自Pierce，蛋白酶和磷酸酶抑制剂购自Roche。抗PARP，抗磷酸化H2A.X购自Cell Signaling，抗β-tubulin抗体购自Sigma。 　　1.2细胞培养与处理 　　 SK-BR3细胞用含10%胎牛血清，100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素，4.5mg/ml L-谷氨酰胺以及4.5g/mL的DMEM培养基中，于37℃，5% CO2条件下培养。2～3d换液一次，待细胞生长至密度为80%时用于下一步研究。 　　1.3 细胞增殖实验 　　 采用MTT法检测细胞的增殖活性。即，100 μL细胞接种于96孔板中培养12h后换成含5%胎牛血清和1mg/ml青霉素、链霉素的培养基。加入不同浓度的LAP或LBH589后继续培养72h。结束前4 h各孔加入MTT溶液20 μL（5 %），弃上清，并加入200 μL二甲基亚砜，充分混匀，用酶标仪测定各孔的吸光度值（A570），并计算抑制率。抑制率=（对照组A值-实验室A值）/对照组A值×100%。 　　1.4流式细胞术检测细胞周期和凋亡 　　 细胞经拉帕替尼和（或）帕比司他处理结束后，用70%的冷乙醇固定，4℃过夜。PBS洗涤2次，核糖核酸酶（RNase） 100μg/ ml 水浴30 min。加碘化丙啶（PI） 50μg/ ml ，室温避光孵育20 min，300目尼龙膜过滤，用流式细胞仪检测细胞周期分布。 　　1.5 Western blot 　　 采用含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液（25mmol/L Tris-HCl pH7.4，150mmol/L NaCl，1% NP-40，1% SDS）裂解细胞，并用Bradford法于595nm波长处测定蛋白浓度。取等量蛋白精8%～10% SDS后，转印至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭后，分别加入一抗和HRP标记二抗孵育，ECL显影。 　　1.6 统计学分析 　　 应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，数据用X±s表示，并采用单因素方差分析数据，Plt;0.05为差异具有统计学意义。 　　2结果 　　2.1 拉帕替尼和帕比司他均可抑制SK-BR3细胞增殖 　　 如图1所示，随着拉帕替尼和帕比司他剂量的增加，各自单药及联合使用对SK-BR3细胞的生长抑制作用逐渐加强。当两者联合使用对SK-BR3细胞抑制率为50%时，拉帕替尼和帕比司他的联合系数为0.90。 　　图1. 拉帕替尼协同帕比司他抑制SK-