棉花GhGGPase2基因克隆功能序列分析原核表达及烟草遗传转化.docVIP

棉花GhGGPase2基因克隆功能序列分析原核表达及烟草遗传转化 　　摘要：以棉花纤维组织为材料，根据NCBI棉花EST进行同源搜索、比对和序列拼接，经RT-PCR从陆地棉纤维组织中扩增得到L-半乳糖磷酸化酶基因（GhGGPase2）的cDNA开放阅读框为1 335 bp，为包含445个氨基酸的蛋白质，分子质量约为49 ku。利用软件进行蛋白质序列分析，GhGGPase2蛋白具有组氨酸三聚体（HIT）蛋白超家族的主要特性的结构域。进化树分析的结果表明棉花GhGGPase2与猕猴桃AdGGPase在进化上亲缘关系上较近。构建原核表达载体pET28a-GhGGPase2并转化大肠杆菌，将重组载体pET28a-GhGGPase2导入大肠杆菌BL21（DE3）中通过IPTG诱导表达后经过SDS分析，显示成功获得分子质量为49 ku左右的诱导表达蛋白GhGGPase2。将GhGGPase2基因构建到植物真核表达载体pCAMBIA2300中，利用农杆菌通过叶盘法转化烟草，经PCR分子鉴定，获得了含GhGGPase2转基因烟草植株。研究结果将为进一步阐明该基因的生物学功能奠定基础。 　　关键词：棉花纤维；L-半乳糖磷酸化酶基因；原核表达；克隆；遗传转化 　　中图分类号： S562.032 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0026-05 　　棉花是全球重要的经济作物，也是我国重要的农产品及纺织原料，是国民经济的支柱产业之一，具有极其重要的战略地位[1]。棉花纤维品质中最重要的参考指标是纤维的强度和长度，而细胞的伸长或膨大发育与纤维的最终品质密切相关[2]。抗坏血酸是广泛存在于植物组织中的一种抗氧化小分子物质，尤其是在细胞分裂旺盛的植物组织中含量较高，不仅对植物生长发育、防卫、分化等许多生理过程起重要作用，还与细胞伸长密切相关[3-5]。棉花纤维细胞的结构是长而不分支的单细胞，是研究细胞生长发育与分化的理想材料。之前的研究表明：抗坏血酸代谢可能参与纤维的发育过程[6]。 　　目前已知的植物体内抗坏血酸生物合成途径中，甘露糖/L-半乳糖途径（又称为Smirnoff/Wheeler途径）是主要途径[7]。L-半乳糖磷酸化酶（GDP-L-galactose phosphorylase，GGPase）基因的表达产物是L-半乳糖磷酸化酶（GGP），该酶能够将GDP-L-半乳糖转化成GDP-L-半乳糖-1-磷酸，是甘露糖/L-半乳糖途径中的重要基因，对植物抗坏血酸的合成起着重要作用。目前已在拟南芥、猕猴桃、烟草、大豆、蓖麻、柑橘、葡萄、番茄和马铃薯等多种植物中分离出GGPase基因。通过转基因研究表明在多个物种中过量表达GGPase基因可提高植物体内抗坏血酸的含量[7-15]。 　　对棉花GGPase2基因的克隆、功能分析、原核表达和转化烟草，有助于解析抗坏血酸参与棉纤维发育的重要功能。从处于快速伸长发育时期的棉花纤维组织中克隆得到了抗坏血酸合成途径中的关键基因（GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因）GGPase2，并对其编码的蛋白进行序列功能结构域分析，构建原核表达载体并转化大肠杆菌BL21（DE3）进行重组蛋白的诱导表达，构建植物表达载体并转化烟草，为深入探究抗坏血酸和GGPase参与棉花纤维发育的重要功能奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 植物材料 植物材料为陆地棉徐-142棉花纤维，由笔者所在实验室培养。经液氮速冻后于-70 ℃保存备用。 　　1.1.2 菌株与质粒 大肠杆菌菌株（Escherichia coli）、Top10由本实验室保存；克隆载体为大连宝生物pGEM-T vector；原核表达载体为pET28a，真核表达载体为pCAMBIA2300由笔者所在实验室保存。 　　1.1.3 酶及生化试剂 RNA反转录试剂盒、TaKaRa LA Taq DNA 聚合酶、T4-DNA 连接酶、EcoRⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ、KpnⅠ和XbaⅠ等相关酶购自大连宝生物公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取微量试剂盒购自TIANGEN公司；其他相关试剂均为国产分析纯，购自上海生工生物工程公司。 　　1.1.4 主要仪器 高压蒸汽灭菌锅（HVE-50）、Eppendorf 5417 R型台式冷冻离心机、电泳仪（Tannon Epson100型）、PCR仪（Biomotra Tpersonal）、凝胶成像系统、超净工作台（BHC-1300A/B3）、恒温培养箱（HIQ-X100）、恒温摇床（HWY-100B）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 棉花总RNA的提取 根据改良的CTAB法[16]提取棉花总RNA。所使用的研钵经高温烘烤数小时，其他器皿均用DEPC水处理[17]。