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毛木耳多糖对乙醇性肝损伤保护作用 　　摘要：采用乙醇诱导正常人肝细胞L02形成乙醇性肝损伤的体外模型，通过检测细胞内甘油三酯（TG）、活性氧（ROS）含量、胞外谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）活性等指标，评价毛木耳多糖提取物对乙醇性肝损伤的的保护作用及机理。结果表明，毛木耳多糖提取物的最佳作用浓度为40 μg/mL时，与模型组相比较，细胞的存活率提高了26.84百分点，细胞内甘油三酯的含量显著下降，胞外转氨酶ALT和AST的活性降低。这一结果说明毛木耳多糖提取物能够提高损伤细胞的存活率，降低乙醇引发的肝内脂肪堆积，减少细胞凋亡，同时游离活性氧的检测结果显示毛木耳多糖提取物能够显著降低细胞内活性氧的含量，从而可推断其可能是通过抗氧化途径发挥防护作用。 　　关键词：毛木耳；多糖；乙醇性肝损伤；活性氧；胞外转氨酶 　　中图分类号： R284.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）12-0142-03 　　乙醇进入体内后主要是通过肝脏来完成代谢的，如果摄入的乙醇量过大，细胞色素P450 2E1（CYP2E1）会被诱导表达参与乙醇的代谢，产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）。ROS能够与生物大分子反应造成蛋白变性、酶失活、DNA结构改变、脂质过氧化，从而造成细胞的损伤[1]。大量摄入乙醇不仅引发肝损伤，还会促使乙醇性脂肪肝的形成，并向乙醇性肝炎、乙醇性肝纤维化、肝硬化转变[2]。据2006年公布的我国首部《中国居民营养与健康之行为和生活方式调查报告》中显示，我国居民现在饮酒率为21%，这一数字还在不断上升[3]，乙醇已成为继病毒性肝炎之后导致肝损害的第二大病因。 　　食用菌类多糖是一种非特异性免疫促进剂，能增强网状内皮系统的吞噬功能，提高调整机体免疫功能[4]；研究表明大多数食用菌多糖对各种病毒如流感病毒、单纯胞疹病毒等具有抑制作用[5]；研究发现多糖的多种生物活性均与抗氧化性有关，通过缓解疾病、辐射、代谢等引起的氧化应激达到治疗和预防肿瘤发生、免疫力低下等疾病[6]。多糖的抗氧化性可能是其多种活性的作用机理之一。毛木耳多糖具有抗氧化[7]、提高免疫[8]、降低血糖血脂[9]等功能，并且可以抑制化学致癌物及促癌物对肿瘤的诱发[10]，因此在保健食品方面具有广阔的应用前景。毛木耳多糖保护乙醇性肝脏损伤功能研究是一个全新的领域。本研究主要目的是在乙醇性肝损伤模型的基础上，探索毛木耳多糖提取物保?o肝细胞乙醇性损伤的作用，为毛木耳多糖的开发以及深加工食品的研发奠定基础。 　　1材料与方法 　　1.1材料与仪器 　　细胞株L02，购自中国医学科学院肿瘤医院；毛木耳3号菌株，笔者所在实验室保藏菌株；胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培养液、胰酶和双抗（青霉素和链霉素），购自美国Invitrogen公司；MTT测试液，购自美国Sigma公司；二甲基亚砜（DMSO），购自美国Amresco公司；台盼蓝染液和无水乙醇，购自国药集团化学试剂有限公司；BCA蛋白质定量检测试剂盒，购自北京博迈德生物技术有限公司；甘油三酯（TG）酶法测定试剂盒、谷草转氨酶（AST）测试盒、谷丙转氨酶（ALT）测试盒和细胞活性氧（ROS）试剂盒，购自南京建成科技有限公司。 　　MSC-1.2生物安全柜，购自美国Thermo公司；Steti-cycle371 CO2培养箱，购自美国Thermo公司；R-215旋转蒸发仪，购自瑞士Buchi公司；HYC-360药品保存箱，购自中国海尔公司；SHZ-88A恒温水浴锅，购自北京精科华瑞仪器有限公司；5810R冷冻离心机，购自美国Eppendrof公司；IX-71倒置显微镜，购自日本Olympus公司；移液器，购自美国Drummond公司。 　　1.2试验方法 　　1.2.1毛木耳多糖提取物的制备将毛木耳子实体放入高速万能破碎机进行破碎制备成约100目的均一干粉。称取50 g干粉，按1 ∶60比例加入去离子水，静置3 h，利用水浴摇床控制温度和转速对混合溶液进行提取，条件控制为 90 ℃、水浴4 h，6 000 r/min离心30 min，取上清，将沉淀物以上述方法再提取1次，合并上清液，利用旋转蒸发技术浓缩，确定多糖溶液的体积，加入4倍体积的无水乙醇使多糖析出，静置过夜待固液分离。通过6 000 r/min离心30 min，获得固体多糖，放至60 ℃的烘箱中烘干直至质量恒定，研磨成粉末状待用。功能检测时将多糖粉末配制成500 μg/mL的母液，其中多糖浓度以硫酸-苯酚法测定[11]。 　　1.2.2乙醇性损伤模型的建立L02细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液（含1%青霉素、链霉素混合液）置 37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培