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氟乐灵降解菌株分离鉴定及降解特性研究 　　摘要： 分离筛选出1株能高效降解养殖水体中氟乐灵的微生物菌株FJ-01，经生理生化和序列同源性分析，将该菌株鉴定为Leucobacter菌。结合水产养殖的实际情况，该菌降解氟乐灵的最适pH值为6.0～8.5，最适温度为22～30 ℃，最佳光照条件为光暗比12 h∶ 12 h，最佳接种量为0.01%，氟乐灵的初始浓度0.05 mg/L。 　　关键词： 氟乐灵；生物降解；16S rDNA；Leucobacter菌；降解特性 　　中图分类号：X172 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）03-0390-04 　　氟乐灵（trifluralin），别称氟乐宁、氟特力、茄科宁等，化学名称为2，6-二硝基-N，N-二丙基-4-三氟甲基苯胺，分子式C13H16F3N3O4。实际生产中氟乐灵的常用剂为48%的乳油制品，是一种广泛应用的二硝基苯胺类选择性芽前除草剂。因其在虾蟹育苗及养殖过程中可治疗和预防真菌病（链壶菌病）[1]且具灭苔不伤草的功效，也广泛应用于水产养殖中。 　　然而有研究表明，氟乐灵可使受试动物发生癌变、染色体突变并对哺乳动物具有基因毒性[2-4]。氟乐灵对哺乳动物、虾、蟹、鸟类的毒性较低，但对鱼类的毒性很大[5]。针对氟乐灵的使用情况和有关毒理学试验数据，2004年11月底，美国环保署再次修订氟乐灵最高残留限量[6]，重新修订后为 0.05 mg/kg。2010年日本多次检出我国出口的鳗鱼、梭子蟹等水产品中氟乐灵超标，对我国渔业经济造成一定影响。 　　利用微生物来降解农药最早报道于1951年，当时 Audus[7]研究了土壤微生物对2，4-D的降解，引发了世人对微生物降解能力的关注。微生物降解技术相对于物理、化学技术，具有高效、彻底、无二次污染和成本低等优势，已成为近年来研究的热点。 　　目前对于氟乐灵的研究主要着重于其对动植物的影响，在土壤中的迁移、转化、降解[8-10]以及检测方法[11-13]。对于如何去除水环境和生物体内的氟乐灵报道较少，因此筛选更多类型水体中的氟乐灵高效降解菌对于氟乐灵残留的生物修复研究和应用具有十分重要的意义。本研究从受污染池塘底泥中筛选到1株可降解低氟乐灵浓度的菌株，并研究其降解特性，以期为合理使用渔用药物和保证水产品质量安全提供理论基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 氟乐灵降解菌分离源 　　氟乐灵降解菌分离自江苏宜兴多年使用过氟乐灵的虾蟹养殖池塘的底泥。采用柱状采泥器采集5个不同的池塘底泥各500 g，装入无菌的玻璃广口瓶中，4 ℃保存下运回实验室备用。 　　1.2 培养基与试剂 　　菌株富集所用的培养基（葡萄糖1 g、蛋白胨10 g、硝酸铵0.2 g、酵母膏0.06 g、磷酸氢二钾0.1 g、磷酸二氢钾0.2 g、氯化钠1 g、水1 L），pH值为7.0～7.5，121 ℃灭菌20 min。 　　菌株驯化培养所采用的无碳源培养基（硝酸铵0.2 g、磷酸氢二钾0.1 g、磷酸二氢钾0.2 g、氯化钠1 g、水1 L），pH值为7.0～7.5，121 ℃灭菌20 min。 　　菌株保存培养基采用液体或固体的肉汤培养基[牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、氯化钠5.0 g（固体需加琼脂20 g）、蒸馏水1 L]，pH值为7.0～7.5，121 ℃灭菌20 min。 　　1.3 氟乐灵降解菌株的筛选、分离和纯化 　　无菌条件下取养殖池塘的底泥1 g，置于经灭菌冷却的99 mL富集培养基中，30 ℃、150 r/min振荡48 h培养。将经富集培养后的底泥悬浊液静置0.5 h，在无菌条件下取1 mL上清液于99 mL富集培养基中按上述条件继续培养48 h。取10 mL经培养所得的菌液于250 mL无碳源培养基（含 0.01 mg/L 氟乐灵）中，培养（条件均为30 ℃、150 r/min）48 h后将菌液转接至下一批次新的无碳源培养基中，并逐步加大无碳源培养基中氟乐灵的浓度，从0.01 mg/L提高至 2.0 mg/L。每次转接前需测定培养液中氟乐灵的实际含量，浓度有明显下降则表明培养液中有降解菌株的存在。 　　将混合培养物经含2.0 mg/L氟乐灵的无碳源培养基平板涂布，并将其进行分离化，取最终的驯化培养液1 mL于 9 mL 无菌水中，得到10-1的稀释度，并依次获得10-2和10-3的稀释度。从3个不同的稀释度中取样，在含2.0 mg/L氟乐灵的无碳源培养基平板上进行涂布分离，每个稀释度做3个平行，放入30 ℃的恒温培养箱中培养3 d。选择菌落疏密适当的平板，在显微镜下观察，挑取生长状况良好、形态不同的菌落于液体肉汤培养基中培养，再将分离所得的各菌株在平板上连续转接、传代5次，选择其中能在含氟