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枯草芽孢杆菌代谢组样品前处理方法比较研究 　　摘 要 本研究比较了不同淬灭剂（甲醇、60%甲醇、60%甲醇0.9% NaCl、60%甲醇0.9% （NH4）2CO3和60%甲醇0.9% NaAc）条件下胞内物质核酸、蛋白质和代谢物的渗漏情况，发现60%甲醇0.9%（NH4）2CO3和60%甲醇0.9% NaAc渗漏最少；比较了珠磨法、液氮研磨法、超声破碎3种细胞破碎方法条件下代谢物的提取效果，发现珠磨法提取效果最佳；比较了不同衍生时间（0.5～2.5 h）下代谢物相对丰度的变化，发现衍生时间达到2.0 h后，代谢物丰度不再有显著变化。最终确定了枯草芽孢杆菌代谢组样品最适前处理方法：预冷的60%甲醇0.9%（NH4）2CO3淬灭， 珠磨法破碎细胞， 细胞破碎物用OBis＼[三甲基硅烷＼]三氟乙酸盐（MSTFA）衍生2 h。采用本方法从枯草芽孢杆菌中共鉴定到223种代谢物，包括大量氨基酸、有机酸和糖类物质。本研究为枯草芽孢杆菌的代谢组学研究提供了基础。 　　关键词； 代谢组学； 枯草芽孢杆菌； 气相色谱质谱联用； 前处理 　　1 引 言 　　微生物代谢组学旨在分析微生物体系中所有的代谢物。由于代谢物结构的多样性及其浓度分布范围的宽广性，检测尽可能多的代谢物及其含量始终是一个巨大的技术挑战[1，2]。尽管代谢组分析技术近年来获得了快速发展[3～5]，但是在代谢组样品制备环节仍然存在诸多问题[6～11]。代谢组学分析技术主要包括核磁共振（NMR）、气相色谱质谱联用（GCMS）和液相色谱质谱联用（LCMS）技术。NMR技术具有样品处理简单、样品破坏性小等优点，但是相比质谱技术灵敏度较低，检测动态范围比较窄。LCMS技术的代谢物适合范围广，可以与多种质谱联用，灵活性和普适性好，但是缺乏完备成熟的标准谱图库，难以高效准确地鉴定代谢物。采用GCMS技术，难挥发性样品需要衍生化，样品处理相对繁琐，但是其有最完整的标准图库，代谢物谱图可检索性较强，定性鉴定方便，因此在代谢组学研究中应用广泛。 　　基于GCMS的代谢组学分析方法，其样品前处理环节包括淬灭、破碎提取和衍生等步骤，各个步骤对分析质量都有较大的影响。理论上， 一种代谢组样品处理方法无法适合于所有种类的的微生物，因为不同种类微生物的细胞结构不同。目前， 关于微生物代谢组研究有许多报道，但所采用的样品处理方法在细胞淬灭、破碎和衍生化等步骤存在诸多差异。如在样品淬灭环节采用不同的溶剂，主要是60%甲醇或者在60%甲醇中添加一定比例的盐[12～14]。液氮冷冻也是细胞淬灭的常用方法[14]，但主要用于动植物组织样品的处理，由于该法无法分开胞内外物质，因此不适于微生物代谢组的研究。细胞破碎方法，主要有珠磨法、超声破碎法和液氮研磨法等[15，16]。在样品衍生化环节可以采用不同的衍生试剂，其中OBis[三甲基硅烷]三氟乙酸盐（MSTFA）作为衍生剂使用比较广泛，文献报道中其衍生时间不尽相同[17～21]。 　　枯草芽孢杆菌是一种重要的工业微生物[22]，广泛应用于蛋白酶和淀粉酶等酶制剂的生产、废水处理、饲料和益生菌行业，同时它也是基础研究领域重要的模式微生物，常用于研究芽孢的形成机制。因此，枯草芽孢杆菌代谢组学研究具有重要意义，但目前有关其代谢组学的研究报道较少，在Meyer等[23]对枯草芽孢杆菌的代谢组分析研究中，并没有对前处理方法展开深入研究。哪些方法更适合于工业微生物枯草芽孢杆菌的研究并没有相关的研究报道。本研究在淬灭、破碎提取和衍生3个重要环节对样品前处理方法进行了比较研究，确定最适合枯草芽孢杆菌的代谢组学研究的样品前处理方法，为枯草芽孢杆菌代谢组学分析研究提供技术支持。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　JY92II DN超声波细胞粉碎机（宁波新艺超声设备有限公司）；Precellys 24多功能样品均质器（法国Bertin Technologies 公司）；MilliQ Advantage A10超纯水制备系统（美国Millipore公司）；7890 A 型气相色谱5975 C型四极杆质谱联用仪（美国Agilent公司）；TU1810系列紫外可见分光光度计（北京普析通用有限公司）。 　　枯草芽孢杆菌AS1.398取自天津科技大学菌种保藏中心。色谱级十五烷酸、甲氧胺盐酸盐、添加有1% 三甲基氯硅烷（TMCS）的MSTFA购自Sigma公司；色谱纯乙腈、甲醇和吡啶购自天津康科德科技公司； NaCl、（NH4）2CO3和NaAc为分析纯，购自天津博欧特化工贸易有限公司；蛋白胨和酵母提取物购自英国Oxoid公司；实验用水为MilliQ超纯水。 　　2.2 实验方法 　　2.2.1 菌体培养 枯草芽孢杆菌 AS1.398采用LB液体培养基（1% NaCl，1