转基因玉米可视芯片检测方法（征求意见稿）.docVIP

ICS FORMTEXT FORMTEXT 点击此处添加中国标准文献分类号 FORMTEXT FORMTEXT SN 中华人民共和国 FORMTEXT 出入境检验检疫行业标准 FORMTEXT XX/T FORMTEXT XXXXX— FORMTEXT XXXX FORMTEXT FORMTEXT 转基因玉米可视芯片检测方法 FORMTEXT Method for the Detection of Genetically Modified Corn Using Optical Thin-?lm Biosensor Chip FORMTEXT 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 FORMDROPDOWN FORMTEXT （本稿完成日期：2013-9-24） FORMTEXT XXXX - FORMTEXT XX - FORMTEXT XX发布 FORMTEXT XXXX - FORMTEXT XX - FORMTEXT XX实施 FORMTEXT 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 XX/T XXXXX—XXXX PAGE \* MERGEFORMAT 6 前言 本标准依照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局，北京大学。 本标准主要起草人：章桂明、向才玉、凌杏园、潘广、陈浩东、邓兴旺。 转基因玉米可视芯片检测方法 范围 本标准规定了进出境玉米中转基因品系的可视芯片检测方法，规定了检测用引物、反应体系及条件，确定了结果判定标准。 本标准中检测方法适用于转基因玉米Bt176、59122、NK603、3272、GA21、MON810、MON88017、MON89034、MIR604、MON863、MOB87460、T25的品系检测和复合品系检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 6682 分析实验室用水规格和试验方法（eqv ISO 3696:1987） GB/T 19495.1 转基因产品检测 通用要求和定义 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T 19495.3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 原理 可视芯片技术是一种新型基因芯片，与传统基因芯片不同，它可以直接通过肉眼观察到的信号。将核酸探针按一定模式点置在芯片上制成检测芯片，通过多重PCR扩增获得的生物素化的PCR产物与芯片上的探针杂交，然后加入检测试剂（含有链霉亲和素修饰的碱性磷酸酶，SA-AP），SA-biotin特异性结合，再加入显色试剂（NBT/BCIP), AP与显色底物NBT/BCIP反应，阳性检测结果会在芯片表面形成肉眼可视的色点。 设备用具及试剂 设备及用具 组织粉碎机、PCR仪、水浴锅、电子天平（精度：1/1000以上）、低温冷冻高速离心机、低温冰箱、制冰机、恒温干燥箱、pH计、移液器（0.1μL , 0.5μL，2 μL, 10 μL, 20 μL, 100 μL, 200 μL, 1000 μL）、紫外可见分光光度计、纯水机、高压消毒锅、杂合反应仪（或使用可放置96孔板的恒温混匀器也可）、芯片点样仪、紫外交联仪、生物芯片、PCR管（0.2 mL）、离心管（1.5 mL，2.0 mL）、Tip 头（0.1 μL ~10 μL，5 μL ~200 μL，100 μL ~500 μL）。 试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。 CTAB。 Tris饱和酚。 氯仿。 异戊醇。 异丙醇。 70%酒精。 RNA酶（10 mg/mL）。 Taq DNA聚合酶。 探针缓冲液：175.3 g NaCl，88.2 g柠檬酸钠，溶于1000 mL DEPC（焦碳酸二乙酯）水中，HCl调节PH至7.0，高压灭菌。 漂洗缓冲液：800 mL 超纯水中溶解0.27 g KH2PO4，1.42 g Na2HPO4，8 g NaCl，0.2 g KCl，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到 杂交反应液：1000 mL蒸馏水溶液中包括9.89% 葡聚糖硫酸钠，0.199% 顺丁烯二酸，0.21% NaOH，0.087% NaCl，0.65%硼酸，1% 牛血清白蛋白。 检测液：15 g标记有碱性磷酸酶的链霉亲和素溶液（25μmol/mL），3.11 g NaOH，150 mL 0.1% Tween-20，10 g