海洋来源产淀粉酶放线菌分离鉴定诱变选育及培养条件优化.docVIP

海洋来源产淀粉酶放线菌分离鉴定诱变选育及培养条件优化 　　摘 要:采用鉴定培养基初步筛选产淀粉酶的菌株,利用YOO改良法测定其酶活力,复筛产酶能力强的菌株作为研究对象.通过热、超声波及紫外线等多种物理诱变选育高产淀粉酶菌株;采用单因子及正交试验优化菌株产酶培养条件.通过形态鉴定、生理生化鉴定以及分子生物学手段对其16S rDNA进行测序,建立系统发育树,进行系统学分析.结果从浙江舟山沿海海泥、海藻中分离到产淀粉酶的放线菌菌株43株,其中产淀粉酶能力较高的3株.放线菌A24产淀粉酶能力经选育后有较大提高:从初始酶活力111.5 U#8226;mL-1经紫外诱变增至282.7 U#8226;mL-1,再经培养优化后提高到353.67 U#8226;mL-1.经形态、生理生化鉴定及16S rDNA的系统发育学分析结果表明A24菌株为Streptomyces sp.A24, GenBank登录号GU184337. 　　关 键 词:淀粉酶; 放线菌; 分离; 鉴定; 诱变; 培养优化 　　中图分类号:Q?@93 文献标志码:A 文章编号:1008-9497(2010)06-680-06 　　 　　淀粉酶(amylase)是能够催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一群酶的总称.它广泛存在于动植物和微生物中.如今淀粉酶在酶市场销售中占据了约25%的比例.它在制糖,纺织、造纸、发酵、烘烤、蒸馏等工业中发挥着重要的作用,此外它也可作为促消化剂运用于食品、医药工业.淀粉酶的巨大潜力使其在当今社会中需求量日益提高.因此,如何获得高产量、高活性的淀粉酶显得至关重要.前人对来源于陆地的产淀粉酶菌株的研究已有很多,如生产耐高温淀粉酶的菌株有嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillus stearothermophilus[1]、热溶芽孢杆菌Bacillus caldolyticus[2]、凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans[3]等;来自盐碱环境的中度嗜盐细菌,例如不动杆菌Acinetobacter SP.[4],喜盐微球菌Micrococcus halobius[5],以及酵母菌中黄色隐球酵母Cryptococcus flavus[6]和盐单胞菌Halomonas meridiana[7]等.对于来源于海洋的产淀粉酶菌株的研究亦越来越广泛深入,如分泌耐酸淀粉酶的海洋酵母菌普鲁兰短梗霉Aureobasidium pullulans[8],生产热稳定淀粉酶的超嗜热古菌[9],生产碱性淀粉酶的海洋盐沼盐杆菌Halobacterium salinarum等[10],但是对海洋来源放线菌的研究相对较少[11-13].本研究旨在从浙江舟山附近海域进行多层次取样,筛选出产淀粉酶能力较强且通过选育手段可使其产酶能力提高较多的放线菌,并从形态、生理生化和分子水平上对目的菌株进行鉴定,为扩大产淀粉酶菌株来源提供可能性. 　　 　　1 材料和方法 　　 　　1.1 材 料 　　1.1.1 主要仪器和试剂 　　冷冻离心机Eppendorf 5417R(艾本德中国有限公司);PCR仪(Whatman Biometra );细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司);PCR扩增试剂盒(上海生物工程有限公司);PCR产物胶回收试剂盒(上海博彩生物科技有限公司);pMD19-T质粒(大连宝生物工程有限公司);PCR扩增引物(上海英潍捷基贸易有限公司). 　　1.1.2 培养基 　　高氏Ⅰ号琼脂培养基[14],产淀粉酶鉴定培养基[14],菌株鉴定用培养基参照文献[15]制备. 　　1.2 样品采集和菌株分离 　　2007年6月从浙江舟山东极、定海海滨公园、定海鸭蛋山码头采集海泥、海水、海草等样品,采用涂布法接种于高氏Ⅰ号培养基,挑取不同菌落形态的菌株进行多次划线分离纯化,获得各放线菌菌株的纯培养物,编号保存. 　　1.3 菌株的定向筛选 　　将上述纯培养放线菌经活化后,无菌操作点接种于添加有曲利本蓝的产淀粉酶定性培养基,28 ℃培养5~7 d后观察产水解圈情况.产生水解圈的菌株同一时间各取一环接入相同量的液体培养基中,在相同培养条件下振荡培养6 d后用Yoo改良法[14]测定酶活,酶活力较高者初步确定为进行下一步诱变选育的目标菌株. 　　1.4 高产淀粉酶菌株的物理诱变选育 　　将培养6 d的A19、A24、A50出发菌株制备成孢子悬浮液,稀释到合适浓度(OD600值为0.5±0.15).分别进行不同梯度的紫外诱变、热诱变及超声波诱变.将诱变后的菌株涂布到产淀粉酶鉴定培养基上,28 ℃培养5~7 d.观察水解圈大小,挑选水解圈较大者用Yoo改良法测定酶活力,确定下一步进行培养优化目标菌株. 　　1.5 高产淀粉酶菌株摇