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溶出型抗菌纺织品体外细胞毒性评价 　　摘要 　　目的：探究溶出型抗菌纺织品的体外细胞毒性。方法：用MTT比色法检测溶出型抗菌纺织品浸提液浓度对小鼠成纤维细胞L929细胞相对增殖率的影响，并评价其细胞毒性。结论：细胞存活率随着溶出型抗菌织物浸提液浓度的提高有所下降，但均高于空白对照组的70%，不认为被测试样有潜在细胞毒性。 　　关键词：抗菌；纺织品；溶出型；细胞毒性；MTT比色法 　　1 引言 　　据国内外学者研究，人体皮肤表层存在三类菌群：（1）常驻菌群（是保护人体免受有害微生物侵袭的屏障）；（2）过路菌群（往往是致病菌或条件致病菌）；（3）共生菌群（对常驻菌群有支持作用，对过路菌群有拮抗作用）。这三类菌群与皮肤共同构成一个动态平衡的微生态系统，一旦平衡被打破，即可能导致皮肤感染或其他疾病[1]。抗菌纺织品具有抗菌卫生自洁功能，一般为内衣、鞋袜等直接接触皮肤的纺织品，所以对其生物安全性提出很高要求，需在抗菌的同时又不会对人体造成伤害[2]。行业标准FZ/T 73023―2012中规定了用晕圈法评价抗菌纺织品所用抗菌剂的溶出安全性。一方面可对抗菌剂的溶出性进行判断，另一方面为抗菌纺织品的安全性提供判定依据。其中规定：按照标准程序洗涤一次后测试，若抑菌圈宽度D1mm，可判定为溶出型抗菌织物；经洗涤一次后，用晕圈法测试溶出性，要求D5mm。非溶出型抗菌?┯胂宋?上的羟基、氨基起反应后与纤维结合，稳定性强、缓释速度均匀，故只触及织物纤维被污染的微生物，绝少接触到皮肤黏膜，具有较高的耐久性与安全性。溶出型的抗菌剂则用交联树脂固着在纤维上，抗菌物质缓释但不均匀，此类产品抗菌效果虽好，但会影响到皮肤层的菌群，所以无论从安全性还是从织物抗菌作用的耐久性考虑，这类抗菌剂不是最佳选择[1]。本文将主要探究溶出型抗菌纺织品的体外细胞毒性。 　　2 试验原理、试剂和材料 　　MTT细胞毒性检测（参照国家标准GB/T 16886.5―2003《医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验》进行）。 　　原理：该检测方法是建立在通过细胞的代谢活性衡量细胞活性的基础上，黄色水溶性MTT[3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5，二苯基溴化四氮唑噻唑蓝]在活细胞内会转化为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒。在甲瓒溶解于乙醇后，通过分光光度计可以测出颜色强度的变化从而推算出活细胞数。 　　试验材料：细胞系，小鼠成纤维结缔组织细胞（L929细胞），由中国科学院细胞库提供。 　　设备和试剂：培养箱、超净工作台、水浴锅、倒置相差显微镜、酒精灯、离心机、电子天平、96孔板分光光度计（配备570nm滤光片，参照650nm）、微板振荡器、细胞计数器或血球计数器、移液器、8道移液器（批量稀释用）、组织培养瓶、96孔组织培养微孔板、注射过滤器。化学试剂、培养基、MEM培养基（不含酚红指示剂）、谷氨酰胺和碳酸氢钠、胎牛血清（FCS）、胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液（PBS）、MTT[3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5，二苯基溴化四氮唑噻唑蓝]、异丙醇（分析纯）。 　　3 试验部分 　　3.1 试验准备工作 　　培养基：准备DMEM （含碳酸氢钠缓冲体系）用于日常培养。10% 胎牛血清、4mM/L 谷氨酰胺、100IU/mL青霉素、100IU/mL链霉素完全培养基置于4℃保存，且保存时间不超过两周。 　　MTT溶液：将MTT溶解于无添加物、无酚红的MEM培养基，浓度为1mg/mL。配好的溶液用注射过滤器过滤除菌（孔径≤0.22?m）。MTT溶液应在配制当天使用。 　　样品及其浸提准备工作：准备10份日常检测中收集的来自不同公司生产的溶出型抗菌织物，厚度均小于0.5mm。样品按ISO 10993-12：2012进行浸提。试样大小：6cm×10cm；阴性对照：2g高密度聚乙烯；萃取液：10mL不含血清的DMEM培养基。振荡24h浸提所有溶液，玻璃器皿等应消毒处理，且所有操作应在超净工作台中的无菌条件和环境下进行。 　　3.2 试验方法 　　第1天：细胞复苏后，要经过2～3次传代才能用于检测。通过酶消化法（胰蛋白酶）将细胞培养物从培养瓶中转移出来，离心细胞悬液（200g、3min），然后将细胞重悬且将细胞浓度调整到1×105 cells/mL。用多道排枪吸取100?L培养基加到96孔培养板的外围孔（空白孔）。在剩余的孔中，加入100?L浓度为1×105cells/mL或1×104cells/mL细胞悬液，培养24h（5%CO2、37℃、湿度90 %）至细胞形成半汇合单细胞层。这个培养期确保细胞恢复且趋向对数生长期，为了避免试验误差，在相差显微镜下观察细胞培养板中细胞生长状况。 　　第2天：培养24h之后，将孔中的培养基吸去。向每孔加入100?L含适当浓度（1