猪瘟病毒强毒株SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法建立.docVIP

猪瘟病毒强毒株SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法建立 　　doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.040[HT9.] 　　摘要：为准确快速诊断猪瘟病毒（classical swine fever virus，简称CSFV）强毒，对GenBank已公布的CSFV 的基因组全序列进行分析，根据CSFV-5′NTR核苷酸序列设计1对特异的荧光定量引物，建立快速检测猪瘟病毒强毒株SYBR Green-Ⅰ实时荧光定量PCR方法。结果表明，该法具有很好的敏感性，对猪瘟病毒最低检出量为10拷 贝/μL；特异性强，与猪瘟兔化弱毒苗、伪狂犬病毒（简称PRV）、猪细小病毒（简称 PPV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（简称PRRSV）、圆环病毒组织苗（简称PCV2）没有交叉反应；重复性好，变异系数（CV）为0.47%～1.36%。该方法可用于猪瘟病毒的快速检测。 　　关键词：猪瘟病毒；强毒株；SYBR GreenⅠ；定量PCR 　　中图分类号： S852.65+1文献标志码： A[HK] 　　文章编号：1002-1302（2017）13-0142-02[HS）][HT9.SS] 　　[HJ1.2mm] 　　收稿日期：2016-03-15 　　基金项目：河北省邯郸市科技局资助项目（编号：1422101047）。 　　作者简介：张永英（1972―），女，河北衡水人，硕士，副教授，主要从事动物疾病防控研究。E-mail：1626074123@。[HJ] 　　[ZK）] 　　猪瘟（简称CSF），是由猪瘟病毒（classical swine fever virus，简称CSFV） 引起的猪的一种热性、致死性、高度接触性传染病，是一种对猪危害性极大的传染病[1]。目前我国将其定为一类传染病，且已纳入国家强制免疫计划[2]。CSFV是单股正链RNA病毒，基因组大小约为12.3 kb。我国CSFV野毒株均属于基因Ⅱ群，而C株属于基因Ⅰ群，由于C株疫苗的广泛使用，即使在实验室检测CSFV野毒感染时，也难以将两者区分开。而且CSFV和牛病毒性腹泻病（简称BVDV）、绵羊边界病毒（简称BDV）同属，均能引起猪的感染，且存在血清学交叉反应，给CSF的鉴别诊断带来了困难。因此，建立一种快捷、准确、灵敏的诊断方法，对有效控制和扑灭猪瘟是非常有必要的。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　CSFV石门系强毒株、HCV兔化弱毒苗、猪繁殖与呼吸综合征病毒（简称PRRSV）、猪细小病毒灭活苗（简称PPV）、伪狂犬病毒灭活苗（简称PRV）、圆环病毒组织苗（简称PCV2）。由河北工程大学农学院预防实验室保存并提供。 　　SYBR Premi Ex Taq、Taq DNA 聚合酶、pMD18-T载体等均购自宝生物工程（大连）有限公司。小量质粒提取试剂盒、胶回收纯化试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司。仪器主要有Bio-RAD Mini荧光定量PCR仪。 　　1.2引物的设计与合成 　　参照GenBank中公布的25株CSFV基因组进行比较分析，采用Primer Experss2.0软件设计了1对特异性引物，上游引物为P1：5′-TTGGCATCATTGCATAAGGG-3′，下游引物为P2：5′-GATTACAACGCCATCTCTGTTACA-3′。引物由北京华大基因科技服务有限公司合成。 　　1.3病毒基因组总RNA的提取 　　参照Trizol试剂使用说明书提取样品总RNA。 　　1.4反转录cDNA的合成 　　参照反转录酶 M-MuLV使用说明书合成 cDNA，反应产物于-20 ℃保存。20 μL反应体系：4 μL模板RNA、2 μL特异性引物P2 、6 μL DEPC水、4 μL 5×buffer、1 μL M-MuLV（200 U/μL）、1 μL RNA抑制剂、2 μL dNTPs，42 ℃水浴 90 min，70 ℃水浴10 min。 　　1.5标准品的制备 　　[JP2]反应结束后取cDNA产物进行电泳鉴定。回收大小为 548 bp 的目的条带，纯化后连接pMD18-T载体、转化大肠杆菌，经双酶切和PCR鉴定为阳性的重组菌按试剂盒说明提取其DNA，D260 nm/D280 nm比值在1.8～2.0的阳性重组质粒用于绘制标准曲线。根据D260 nm值计算质粒浓度并换算成拷贝数，然后10倍稀释成1.0×109～1.0×101拷贝/μL 9个梯度，分别以9个稀释度为模板进行SYBR Green Ⅰ定量PCR检测。并且判定在40个循环内出现特异性扩增曲线的最低拷贝数。[JP] 　　1.6SYBR GreenⅠ定量PCR标准曲线的绘制 　　采用25 μL反??体系：SYBR Prem