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生物反应器工艺生产水痘疫苗可行性研究 　　摘 要：目的：研究生物反应器培养人二倍体MRC-5细胞，并用来制备水痘疫苗的可行性。方法： 将MRC-5细胞接种1L生物反应器，使用GE公司Cytodex 1 微载体，浓度为：3g/L，工作体积300ml，待细胞长满单层后接种水痘病毒，当细胞病变约达75%以上时结束培养，收获细胞培养物及培养液，-80℃快速冻融一次，过滤除去微载体及细胞碎片，收获病毒悬液，测定水痘病毒滴度。结果： 细胞接种反应器后，大约3小时贴壁完成，5小时后开始伸展为长梭形，3天后细胞长成致密单层，接种水痘病毒后大约48小时病变，72小时收获。收获后的病毒滴度检测结果为120，000 PFU/mL。结论 ：二倍体细胞可以在生物反应器中正常生长，并且接种水痘病毒后产生病变，本试验证明了应用生物反应器动态培养二倍体细胞扩增水痘病毒，生产水痘疫苗的方法可行。 　　关键词：水痘；疫苗；生物反应器 　　中图分类号： Q-3.2 文献标识码： A 文章编号： 1673-1069（2016）15-195-2 　　0 引言 　　目前针对水痘和带状疱疹还没有有效的治疗方法，接种疫苗是预防水痘感染的唯一有效手段[1-2]。国外生产水痘疫苗采用细胞工厂工艺进行疫苗制造[3-4]，而国内生产水痘疫苗仍然采用传统的克氏瓶或转瓶工艺进行疫苗生产[5-6]。转瓶培养具有劳动强度大，占地空间大，单位体积提供细胞生长的表面积小，细胞生长密度低，瓶间差异较难控制等缺点，越来越不适应GMP和WHO认证的要求。生物反应器培养技术在国外已有四十多年的应用历史，近十年来在中国开始逐渐普及[7]。由于其便捷安全的操作方式，可控性好，占用较少的空间等优点，生物反应器已被越来越多的国内疫苗生产企业所接受，如辽宁成大、广州诺成等生物科技有限公司生产的冻干人用狂犬病疫苗和乙脑疫苗[8-9]，另外国内有些公司也逐渐开始研究微载体反应器替代转瓶或细胞工厂工艺生产甲肝疫苗、麻疹疫苗等产品[10]。本课题将生物反应器工艺引入水痘疫苗的生产中研究其可行性，现报道如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 细胞株及毒株 　　MRC-5细胞株来源：购买于ATCC；工作代细胞批号为：WC代次为24代。 　　水痘毒株Oka株来源：购买于ATCC；工作代毒种批号为W，代次为47代。 　　1.2 主要耗材 　　175cm2细胞培养瓶（CORNING）；细胞工厂（CORNING）；多道移液器、单道移液器（规格：20～200ul；100～1000 ul，Eppendorf）；玻璃刻度吸管（规格：5mL，10mL等）； 6孔细胞培养板（CORNING）；Cytodex 1 微载体（GE公司）。 　　1.3 主要设备 　　荷兰Applikon生物反应器；天津泰特仪器设备有限公司 电热恒温水浴箱；Thermo生物安全柜；三洋37℃ CO2恒温培养箱；OLYMPUS CKX41倒置显微镜。 　　1.4 微载体培养方法 　　将MRC-5细胞接种1L生物反应器，待细胞长满单层后接种水痘病毒，具体步骤如下： 　　复苏24代MRC-5细胞，至T175细胞瓶中，按1：2比例传代3次至8瓶，镜下观察细胞形态为成纤维细胞形态，呈梭形，细胞排列致密无空隙，准备用于生物反应器培养。 　　反应器用二甲基二氯硅烷硅化处理，微载体经PBS溶胀并清洗处理后加入反应器中，高压湿热灭菌反应器及微载体，准备培养细胞。（微载体使用量3g/L ，培养体积300mL，按培养面积比1：2上罐传代） 　　用0.25%胰酶消化8瓶长满单层T175细胞后，加入预热的细胞生长液吹打均匀，接种至1L反应器中，使用体积为300mL。将1L反应器控制设定温度：37℃；pH值：7.2；溶氧值：40%；调整适当搅拌速度，以微载体混匀且不沉淀的最小搅拌速度为最佳。每天换液300mL，同时取样观察细胞生长状态。待微载体表面的细胞长满均一单层时接种水痘病毒，设定温度：35℃；pH值：7.3；溶氧值：35%；观察细胞病变情况，待细胞病变约达75%以上时结束培养，收获细胞培养物及培养液，-80℃快速冻融一次，过滤除去微载体及细胞碎片，收获病毒悬液，测定水痘原液病毒滴度。 　　1.5 检验方法 　　测定病毒滴度是用蚀斑试验的方法，取人二倍体细胞MRC-5，以pH7.2、含10%小牛血清的MEM细胞培养基接种6孔板，每孔加密度为1×105个/mL的MRC-5细胞悬液3mL，置37℃ 5% CO2培养箱培养3～4天，待MRC-5细胞形成均匀、致密的细胞单层后，弃去原有的生长液。用含3%小牛血清、5%蔗糖和1%谷氨酸钠的PBS缓冲液将待检品做10倍系列稀释，一般取10-2～10-5稀释度的样品接种6孔