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猪胞内劳森氏菌lscN基因克隆及序列分析 　　摘要：胞内劳森氏菌是猪增生性肠炎的病原，试验设计4条引物，采用半巢式PCR从目的DNA中扩增出1 317 bp的胞内劳森氏菌lscN基因，并进行序列分析。结果表明，lscN与GenBank中PHE/MN1-00、N343同源性为99%，是劳森氏菌三型分泌系统组件的编码基因。 　　关键词：胞内劳森氏菌；三型分泌系统；PCR 　　中图分类号：Q785 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2017）12-0010-02 　　猪增生性肠炎（Porcine proliferative enteropathy，PPE）是由劳森氏菌（Lawsonia intracellularis，Li）感染引起的猪接触性肠道传染病[1]。该病主要发生在6～20周龄断奶猪，育成猪也可感染，引起顽固性腹泻，严重降低饲料转化率，导致养猪业受到经济损失[2]。三型分泌系统（Type Three Secretion System，TTSS）是一种跨细菌内外膜、细胞外空间和宿主细胞膜的蛋白运输装置，在革兰氏阴性菌中广泛存在，现已发现存在TTSS的致病菌包括大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、耶尔森氏菌等[3]。英国学者David G.E. Smith 在2009年运用染色体步移技术在Li分离株中鉴定到编码TTSS的基因区域，其中lscN是为效应蛋白跨膜提供能量的ATP酶[4]，因此，本试验对lscN进行克隆及序列分析，为后续LscN蛋白的研究奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 主要试剂 PCR LA Mix、PCR Taq Mix、2 000 bp Marker、T4 DNA ligase、pMD18-T simple载体、DH5α感受态细胞、GoldenView、琼脂糖购自宝生物工程（大连）有限公司；Tris、EDTA-Na2、NaCl、LB培养基由龙岩学院生命科学学院动物医学系提供。 　　1.1.2 引物 从GenBank中下载lscN（LI_RS02940）的序列，使用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物由上海华津生物科技有限公司合成，引物序列见表1。 　　1.2 方法 　　1.2.1 PCR扩增 采用巢式PCR扩增目的片段。第一重PCR反应体系为：2×PCR LA Mix 12.5 μL，引物1、2各1 μL （10 pmol/L），模板DNA 1 μL，加灭菌超纯水至25 μL；PCR 反应条件为：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性40 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min。第二重PCR反应体系为：2×PCR LA Mix 12.5 μL，引物3、4各1 μL （10 pmol/L），第一重PCR产物1 μL（100倍稀释），加灭菌超纯水至25 μL；PCR 反应条件为：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性40 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min。同时设立空白对照。取第二重PCR产物5 μL加入上样缓冲液后进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，用凝胶成像仪观察并记录结果。 　　1.2.2 PCR产物回收 将余下的20 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下将目的条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管中称重。向胶块中加入3倍体积Buffer G，50 ℃水浴10 min，其间温和地上下颠倒数次。然后加入1倍体积异丙醇，上下颠倒混匀。向已装入收集管中的吸附柱中加入200 μL Buffer S，12 000 r/min离心2 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。将前面得到的溶液加入到吸附柱中，室温放置2 min，12 000 r/min离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。吸附柱中加入500 μL Buffer G，12 000 r/min离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱中加入650 μL Buffer W，12 000 r/min离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中，空离2 min。将吸附柱放入1.5 mL离心管中，在吸附膜中央加入10 μL Buffer B，室温静置1～2 min，12 000 r/min离心1 min，回收得到目的片段。 　　1.2.3 PCR产物克隆T载体 取回收目的片段7 μL，pMD18-T载体0.5 μL，T4 DNA ligase 1.5 μL，T4 DNA ligase buffer 1 μL，4 ℃连接过夜。将连接产物5 μL，DH5α 50 μL加入1.5 mL离心管，冰浴30 min，然后42 ℃