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猪丹毒丝菌PCR检测方法建立 　　摘要：根据Ｇｅｎbａｎｋ中猪丹毒丝菌的１６Ｓ ｒRＮＡ基因序列的差异设计特异性引物，对６株临床分离的丹毒丝菌菌株进行ＰＣＲ扩增。结果显示，此引物对６株丹毒丝菌均扩增出与预期大小４７2 ｂｐ相一致的片段，而对多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌等１０种病原体的扩增结果均为阴性；ＰＣＲ敏感性试验结果表明，该方法可以检测到１８６ ＣＦＵ／μＬ的丹毒丝菌，并可以利用临床病料直接进行检测，节省了检测时间和劳动力，能够适用于日常实验室的检测。 　　关键字：丹毒丝菌；１６Ｓ ｒＤＮＡ；ＰＣＲ 　　中图分类号：Ｓ８５２．６１文献标识码：B文章编号：１００７－２７３Ｘ（２０11）05-0007-02 　　 　　丹毒丝菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）是专性厌氧的革兰氏阳性小杆菌［１］。该属主要包括两个种，红斑丹毒丝菌（Ｅ．ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）和扁桃体丹毒丝菌（Ｅ．ｔｏｎｓｉｌｌａｒｕｍ），其中仅红斑丹毒丝菌（俗称猪丹毒丝菌）是具有致病力的毒力种，是猪丹毒和人类类丹毒症的致病菌，猪感染后致死率极高，使养猪业遭受巨大经济损失，同时也对人类的健康构成一定的威胁［２］。丹毒丝菌的血清型很多，现在已经报道有１６种血清型，不同的血清型在毒性上的差别很大，一般从病猪分离的菌株绝大多数是血清型１ａ、１ｂ和２型［３］，能够引起猪的急性或亚急性败血症和慢性的关节炎及心内膜炎，对其他许多畜禽也存在一定的危害［４］。由于丹毒丝菌的营养要求高，细菌菌落较小，分离鉴定繁琐费时，给临床上丹毒丝菌的快速诊断带来了许多困难。为此，湖南农业大学动物医学院病原分子生物学和免疫学实验室根据Ｇｅｎｅｂａｎｋ上的１６Ｓ ｒＤＮＡ序列设计通用引物，建立快速检测丹毒丝菌的ＰＣＲ鉴定方法。 　　 　　１材料与方法 　　 　　１．１试验菌株 　　丹毒丝菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、气单胞菌、李氏杆菌、芽孢杆菌和链球菌，由湖南农业大学动物医学院病原分子生物学和免疫学实验室分离、鉴定和保存；粪肠球菌（ＡＣＴＴ ２９２１２）、大肠杆菌（ＡＣＴＴ ３５２１８）、金黄色葡萄球菌（ＡＣＴＴ ２９２１３）购于杭州天和微生物公司；６株丹毒丝菌临床分离株，分离于湖南各地送检至湖南农业大学传染病实验室的猪病料。 　　１．２主要仪器与试剂 　　Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶购自天根生物工程公司；ｄＮＴＰ（２．５ｍmol/L）、ＤＬ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ均购自大连宝生物工程公司；ＴＳＢ培养基购于北京鼎国昌盛生物技术公司。 　　１．３引物的设计 　　从ＮＣＢＩ库查出已发表的丹毒丝菌所有１６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列中，找出１６Ｓ ｒＲＮＡ基因的保守区；运用ＤＮＡｓｔａｒ中的ＭｅｇＡｌｉｇｎ子程序分别与其他常见细菌（大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌、链球菌）的基因序列进行多重比较，找出丹毒丝菌的特异序列。以ＡＢ０３４２００序列，利用软件Oｌｉｇｏ ６在丹毒丝菌１６Ｓ ｒＲＮＡ基因的特异保守区内设计ＰＣＲ引物，Ｆ：５’－ＴＧＡＣＡＴＡＣＣＧＣＧＣＡＡＡＡＧＣＡ－３’（位置９８２－１００１），Ｒ：５’－ＧＧＣＴＣＣＣＴＣＣＴＡＧＴＡＡＡＣＴＡ－３’（位置１４３４－１４５３），预计扩增产物４７2ｂｐ。 　　１．４ＰＣＲ模板的准备 　　挑取一个菌落置于装有２００μＬ去离子水的离心管中，搅匀。将离心管置于１００℃水浴加热５ｍｉｎ，冰浴冷却，１２ ０００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ，吸取上清至另一离心管，置－２０°Ｃ冻存备用。同时也用纯培养菌落和液体培养菌液直接作为ＰＣＲ模板。 　　１．５ＰＣＲ反应条件选择 　　１０×Bｕｆｆｅｒ ２μＬ，ｄＮＴＰ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，上、下游引物各０．２μＬ（引物量１０μｍｏｌ／Ｌ），Ｔａｑ酶（２．５Ｕ／μＬ）０．５μＬ，模板１μＬ，加超纯水至２５μＬ总体系。９５℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，计算选择首个退火温度５５℃、３０ｓ，然后分别加减１℃共设置10个梯度（50~60℃），７２℃延伸３０ｓ，３０个循环；７２℃终延伸７ｍｉｎ，筛选最佳退火温度。ＰＣＲ产物置于１０ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后在凝胶成像系统拍照分析。 　　１．６ＰＣＲ特异性 　　将本实验室保存菌种多杀性巴氏杆菌、气单胞菌、李氏杆菌、沙门氏菌、芽孢杆菌、链球菌、粪肠球菌（ＡＣＴＴ ２９２１２）、大肠杆菌（ＡＣＴＴ ３５２１８）、金黄色葡萄球菌（ＡＣＴＴ ２９２１３）与丹毒丝菌用１．３设计的引物按照上述ＰＣＲ反应条件对菌株进行扩增，另外将丹毒丝菌的ＰＣＲ产物送往上海生物工程有限公司测序，通过核苷酸序列分析确定ＰＣＲ扩增的片段为目的片段。 　　１．７ＰＣＲ敏感性试验 　　挑取丹毒丝菌固体培养物菌落１个或数个溶于５